用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）分析DBS類固醇激素的方法學(xué)初探

文偉 郭萌 彭紅兵

（深圳市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心 廣東 深圳 518000）

先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一類常染色體隱性遺傳代謝病，由于遺傳因素導(dǎo)致皮質(zhì)類固醇激素合成障礙，導(dǎo)致代謝紊亂，出現(xiàn)一系列電解質(zhì)紊亂、性激素分泌紊亂等導(dǎo)致代謝紊亂和發(fā)育異常，嚴(yán)重者危及生命。其中最常見(jiàn)的是21-羥化酶缺乏癥（CYP21A2）和11-β-羥化酶缺乏癥（CYP11B1）。鹽皮質(zhì)激素合成障礙導(dǎo)致失鹽危象，癥狀包括喂養(yǎng)困難、發(fā)育緩慢、嘔吐、高鉀、低鈉、脫水、代謝性酸中毒。目前，新生兒生后3天（72小時(shí)后）采集新生兒足跟血制成濾紙干血斑（DBS）進(jìn)行新生兒篩查檢測(cè)，用免疫法檢測(cè)干血斑中17-羥孕酮（17-α-hydroxyprogesyerone，17-OHP），早期篩查21-羥化酶缺乏癥。但是常規(guī)新生兒篩查方法用免疫熒光法檢測(cè)干血斑中17-OHP濃度時(shí)，由于新生兒生理原因和基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致假陽(yáng)性率偏高。增加了嬰兒家屬不必要的心理負(fù)擔(dān)和醫(yī)療資源的浪費(fèi)[1]。

采用LC-MS/MS對(duì)DBS標(biāo)本的17-OHP、11-脫氧皮質(zhì)醇、21-脫氧皮質(zhì)醇（21-Deoxycortisol，21-F）、雄烯二酮（4-A）和皮質(zhì)醇（Cortisol）等類固醇激素定量分析，本研究采用LCMS/MS對(duì)干血斑樣品中這五種激素進(jìn)行定量分析方法及性能驗(yàn)證，提高檢測(cè)靈敏度和特異性，減少基質(zhì)效應(yīng)。

1.對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

用Schleicher & Schuell 903＃篩查專用濾紙制備的類固醇激素干血斑標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 設(shè)備與試劑

1.2.1 液相系統(tǒng) Waters ACQUITY UPLC I-Class；質(zhì)譜系統(tǒng)：Xevo TQ-D。

1.2.2 分析軟件 MassLynx及Intellistart 進(jìn)行線性擬合分析、RSD分析、回收率計(jì)算等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 試劑和標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)自Sigma、CDN、MERK、Canada TRC等，色譜級(jí)。

1.3 技術(shù)條件

1.3.1 質(zhì)譜參數(shù)

表1 通過(guò)手動(dòng)調(diào)諧結(jié)合Intellistart自動(dòng)調(diào)諧，確定的質(zhì)譜參數(shù)及MRM（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）離子對(duì)參數(shù)表

1.3.2 MRM離子對(duì)參數(shù)

表2 MRM 離子對(duì)參數(shù)表

1.3.3 液相ACQUITY UPLC系統(tǒng)參數(shù)

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱：保留和分離極性有機(jī)物，保留水溶性，極性大的小分子有機(jī)化合物。

表3 優(yōu)化確認(rèn)的液相方法如下

1.4 DBS類固醇標(biāo)準(zhǔn)品制備與處理

1.4.1 DBS類固醇標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將健康人抗凝血液9000×g離心5分鐘，去上清液，得到健康的紅細(xì)胞；紅細(xì)胞內(nèi)加入等體積的生理鹽水進(jìn)行沖洗，離心后去除上清液，重復(fù)三次，得到干凈的紅細(xì)胞；洗凈的紅細(xì)胞與牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)緩沖（4%BSA）混合，制成含55%紅細(xì)胞的不含類固醇激素全血標(biāo)準(zhǔn)品。取適量的上述全血標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入類固醇4-A、17-OHP、F、21-F、11-脫氧皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成相應(yīng)濃度，各取50ul滴到Schleicher & Schuell 903＃篩查專用濾紙紙片上，室溫晾干（6h左右），即成為DBS類固醇標(biāo)準(zhǔn)品，存放于4℃冰箱待用[2]。

1.4.2 DBS類固醇樣品的分析

待測(cè)樣本用打孔鉗打4個(gè)直徑3mm干血斑（相當(dāng)于12μL全血）于96孔聚丙烯微孔板中；每孔加入200μL丙酮：乙腈（50:50）溶液，20μL內(nèi)標(biāo)工作液，室溫渦旋混合約50分鐘；再加入100μL甲醇，室溫渦旋混合約10分鐘；將每孔樣本轉(zhuǎn)移到另一潔凈96孔板中，40℃氮?dú)獯蹈伞Ｃ靠准尤牒?.1%甲酸的甲醇水（50:50）50ul復(fù)溶，室溫渦旋混合約1分鐘，待進(jìn)樣分析。

2.結(jié)果

F、21-F、11-脫氧皮質(zhì)醇、17-OHP、4-A五種類固醇激素色譜分離（圖1～圖6，表4）

圖1 五種類固醇激素的色譜圖

圖2 4-A的線性擬合圖

圖3 17-OHP的線性擬合圖

圖4 11-Deoxycortisol的線性擬合圖

圖5 21-F的線性擬合圖

圖6 Cortisol的線性擬合結(jié)果

表4 五種激素DBS樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，定量下限和靈敏度

3.討論

LC/MS/MS技術(shù)主要是將被測(cè)物質(zhì)分子電離成質(zhì)荷比（m/s）不同的帶電粒子，然后應(yīng)用電磁學(xué)原理，使這些帶電粒子按照質(zhì)荷比大小在空間或時(shí)間上產(chǎn)生分離、排列成的圖譜，通過(guò)測(cè)定離子峰的強(qiáng)度，以此獲得確定化合物的相對(duì)分子質(zhì)量、分子式。質(zhì)譜峰的強(qiáng)度與它代表的化合物的量成正比，而且混合物的質(zhì)譜是各成分質(zhì)譜的算術(shù)加成譜，據(jù)此，可以進(jìn)行定量分析。LC/MS/MS基本原理就是將兩個(gè)質(zhì)譜儀經(jīng)一個(gè)碰撞室串聯(lián)而成，既用質(zhì)譜儀做混合物樣品的分離器，又用質(zhì)譜儀作為組分的鑒定器。LC/MS/MS技術(shù)有高敏感性，高效、快捷的特點(diǎn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的免疫方法篩查的不足[3]。

我們的研究中對(duì)干血斑標(biāo)本皮質(zhì)醇、17-OHP、11-脫氧皮質(zhì)醇、21-F和4-A等類固醇激素標(biāo)準(zhǔn)品制備，確定了采用Waters UPLC I-Class Xevo TQ-D系統(tǒng)結(jié)合HSS T3色譜柱系統(tǒng)手工和自動(dòng)調(diào)諧，確定質(zhì)譜參數(shù)和MRM離子對(duì)參數(shù)。通過(guò)分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)，分析了每個(gè)類固醇激素的線性范圍、最低定量限和信噪比等參數(shù)。結(jié)果顯示線性擬合較好。

由于正常嬰兒中類固醇激素尤其17-OHP較低，而CAH或應(yīng)急狀態(tài)的嬰兒類固醇激素會(huì)增高，由于該設(shè)備的最低檢測(cè)限為5～10mg/ml， 正常嬰兒的類固醇激素水平在最低檢測(cè)限附近，檢測(cè)結(jié)果可靠性受影響，但是CAH患者或由于其他疾病、應(yīng)激等原因?qū)е?7-OHP明顯增高時(shí)，檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性增加。采用相關(guān)類固醇激素的比值可以更敏感反應(yīng)疾病狀態(tài)、生理應(yīng)激狀態(tài)或其他疾病導(dǎo)致的繼發(fā)反應(yīng)，減少篩查假陽(yáng)性，應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行“二線篩查”[4]。

4.結(jié)論

4.1 使用Waters UPLC I- Class Xevo TQ-D系統(tǒng)結(jié)合HSS T3色譜柱建立了DBS中5種激素同時(shí)測(cè)定的分析方法，分析方法運(yùn)行時(shí)間5min 。其中皮質(zhì)醇、21-脫氧皮質(zhì)醇、11-脫氧皮質(zhì)醇、4-A和17-羥孕酮的保留時(shí)間分別為：1.76’、2.19’、2.42’、2.74’和3.10’。

4.2 皮質(zhì)醇、21-F、11-脫氧皮質(zhì)醇、4-A和17-OHP等5種激素在Xevo TQ-D系統(tǒng)D的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性擬合系數(shù)r2均＞0.99。最低定量限在5～10ng/ml之間。信噪比大于三倍最低定量限。具有較好的靈敏度，線性和重現(xiàn)性結(jié)果。4-A、17-OHP、11-deoxycortisol、21-F及Cortisol定量下限分別為2.5、5、2.5、10、5ng/mL，線性范圍分別為2.5～160 ng/mL、5～320、2.5～320、10～320、5～160ng/mL；5種激素的DBS樣品連續(xù)測(cè)定6針的RSD均在15%以內(nèi)。