用串聯質譜技術（LC-MS/MS）分析DBS類固醇激素的方法學初探

文偉 郭萌 彭紅兵

（深圳市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心 廣東 深圳 518000）

先天性腎上腺皮質增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一類常染色體隱性遺傳代謝病，由于遺傳因素導致皮質類固醇激素合成障礙，導致代謝紊亂，出現一系列電解質紊亂、性激素分泌紊亂等導致代謝紊亂和發育異常，嚴重者危及生命。其中最常見的是21-羥化酶缺乏癥（CYP21A2）和11-β-羥化酶缺乏癥（CYP11B1）。鹽皮質激素合成障礙導致失鹽危象，癥狀包括喂養困難、發育緩慢、嘔吐、高鉀、低鈉、脫水、代謝性酸中毒。目前，新生兒生后3天（72小時后）采集新生兒足跟血制成濾紙干血斑（DBS）進行新生兒篩查檢測，用免疫法檢測干血斑中17-羥孕酮（17-α-hydroxyprogesyerone，17-OHP），早期篩查21-羥化酶缺乏癥。但是常規新生兒篩查方法用免疫熒光法檢測干血斑中17-OHP濃度時，由于新生兒生理原因和基質效應導致假陽性率偏高。增加了嬰兒家屬不必要的心理負擔和醫療資源的浪費[1]。

采用LC-MS/MS對DBS標本的17-OHP、11-脫氧皮質醇、21-脫氧皮質醇（21-Deoxycortisol，21-F）、雄烯二酮（4-A）和皮質醇（Cortisol）等類固醇激素定量分析，本研究采用LCMS/MS對干血斑樣品中這五種激素進行定量分析方法及性能驗證，提高檢測靈敏度和特異性，減少基質效應。

1.對象與方法

1.1 研究對象

用Schleicher & Schuell 903＃篩查專用濾紙制備的類固醇激素干血斑標準品。

1.2 設備與試劑

1.2.1 液相系統 Waters ACQUITY UPLC I-Class；質譜系統：Xevo TQ-D。

1.2.2 分析軟件 MassLynx及Intellistart 進行線性擬合分析、RSD分析、回收率計算等統計學分析。

1.2.3 試劑和標準品 購自Sigma、CDN、MERK、Canada TRC等，色譜級。

1.3 技術條件

1.3.1 質譜參數

表1 通過手動調諧結合Intellistart自動調諧，確定的質譜參數及MRM（多反應監測）離子對參數表

1.3.2 MRM離子對參數

表2 MRM 離子對參數表

1.3.3 液相ACQUITY UPLC系統參數

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱：保留和分離極性有機物，保留水溶性，極性大的小分子有機化合物。

表3 優化確認的液相方法如下

1.4 DBS類固醇標準品制備與處理

1.4.1 DBS類固醇標準品的制備

將健康人抗凝血液9000×g離心5分鐘，去上清液，得到健康的紅細胞；紅細胞內加入等體積的生理鹽水進行沖洗，離心后去除上清液，重復三次，得到干凈的紅細胞；洗凈的紅細胞與牛血清白蛋白標準緩沖（4%BSA）混合，制成含55%紅細胞的不含類固醇激素全血標準品。取適量的上述全血標準品，分別加入類固醇4-A、17-OHP、F、21-F、11-脫氧皮質醇標準品，稀釋成相應濃度，各取50ul滴到Schleicher & Schuell 903＃篩查專用濾紙紙片上，室溫晾干（6h左右），即成為DBS類固醇標準品，存放于4℃冰箱待用[2]。

1.4.2 DBS類固醇樣品的分析

待測樣本用打孔鉗打4個直徑3mm干血斑（相當于12μL全血）于96孔聚丙烯微孔板中；每孔加入200μL丙酮：乙腈（50:50）溶液，20μL內標工作液，室溫渦旋混合約50分鐘；再加入100μL甲醇，室溫渦旋混合約10分鐘；將每孔樣本轉移到另一潔凈96孔板中，40℃氮氣吹干。每孔加入含有0.1%甲酸的甲醇水（50:50）50ul復溶，室溫渦旋混合約1分鐘，待進樣分析。

2.結果

F、21-F、11-脫氧皮質醇、17-OHP、4-A五種類固醇激素色譜分離（圖1～圖6，表4）

圖1 五種類固醇激素的色譜圖

圖2 4-A的線性擬合圖

圖3 17-OHP的線性擬合圖

圖4 11-Deoxycortisol的線性擬合圖

圖5 21-F的線性擬合圖

圖6 Cortisol的線性擬合結果

表4 五種激素DBS樣品標準曲線的線性范圍，定量下限和靈敏度

3.討論

LC/MS/MS技術主要是將被測物質分子電離成質荷比（m/s）不同的帶電粒子，然后應用電磁學原理，使這些帶電粒子按照質荷比大小在空間或時間上產生分離、排列成的圖譜，通過測定離子峰的強度，以此獲得確定化合物的相對分子質量、分子式。質譜峰的強度與它代表的化合物的量成正比，而且混合物的質譜是各成分質譜的算術加成譜，據此，可以進行定量分析。LC/MS/MS基本原理就是將兩個質譜儀經一個碰撞室串聯而成，既用質譜儀做混合物樣品的分離器，又用質譜儀作為組分的鑒定器。LC/MS/MS技術有高敏感性，高效、快捷的特點，彌補了傳統的免疫方法篩查的不足[3]。

我們的研究中對干血斑標本皮質醇、17-OHP、11-脫氧皮質醇、21-F和4-A等類固醇激素標準品制備，確定了采用Waters UPLC I-Class Xevo TQ-D系統結合HSS T3色譜柱系統手工和自動調諧，確定質譜參數和MRM離子對參數。通過分別對標準品的檢測，分析了每個類固醇激素的線性范圍、最低定量限和信噪比等參數。結果顯示線性擬合較好。

由于正常嬰兒中類固醇激素尤其17-OHP較低，而CAH或應急狀態的嬰兒類固醇激素會增高，由于該設備的最低檢測限為5～10mg/ml， 正常嬰兒的類固醇激素水平在最低檢測限附近，檢測結果可靠性受影響，但是CAH患者或由于其他疾病、應激等原因導致17-OHP明顯增高時，檢測靈敏度和準確性增加。采用相關類固醇激素的比值可以更敏感反應疾病狀態、生理應激狀態或其他疾病導致的繼發反應，減少篩查假陽性，應用串聯質譜技術進行“二線篩查”[4]。

4.結論

4.1 使用Waters UPLC I- Class Xevo TQ-D系統結合HSS T3色譜柱建立了DBS中5種激素同時測定的分析方法，分析方法運行時間5min 。其中皮質醇、21-脫氧皮質醇、11-脫氧皮質醇、4-A和17-羥孕酮的保留時間分別為：1.76’、2.19’、2.42’、2.74’和3.10’。

4.2 皮質醇、21-F、11-脫氧皮質醇、4-A和17-OHP等5種激素在Xevo TQ-D系統D的標準曲線范圍內呈線性關系，線性擬合系數r2均＞0.99。最低定量限在5～10ng/ml之間。信噪比大于三倍最低定量限。具有較好的靈敏度，線性和重現性結果。4-A、17-OHP、11-deoxycortisol、21-F及Cortisol定量下限分別為2.5、5、2.5、10、5ng/mL，線性范圍分別為2.5～160 ng/mL、5～320、2.5～320、10～320、5～160ng/mL；5種激素的DBS樣品連續測定6針的RSD均在15%以內。