淫羊藿中淫羊藿苷的高效液相色譜法測(cè)定含量

賈學(xué)忠

淫羊藿富含黃酮類化合物，可增加腦血流量，具有促造血功能、強(qiáng)化免疫及骨代謝和抗衰老等功效。淫羊藿苷為淫羊藿主要藥理成分，是一類黃酮類化合物，在人體內(nèi)分布極廣，并可通過(guò)血腦屏障。近年相關(guān)藥理研究多集中于該物質(zhì)在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及骨組織與泌尿生殖系統(tǒng)的作用機(jī)制等方面。現(xiàn)已明確的是其對(duì)免疫系統(tǒng)有明顯調(diào)節(jié)作用，抗腫瘤作用等。我院將該藥物應(yīng)用于臨床，主要發(fā)揮其補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨的作用，研究方向以其成藥制劑治療男女不孕不育為主[1]。為控制制劑中有效成分含量，進(jìn)一步把握和提升藥品質(zhì)量，筆者以高效液相色譜法測(cè)定制劑中淫羊藿苷含量。現(xiàn)總結(jié)并報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國(guó)Agilent 1100 高效液相色譜系統(tǒng)（含自動(dòng)脫氣機(jī)、VWD檢測(cè)器）。

1.2 試藥

供含量測(cè)定的淫羊藿苷對(duì)照品（陜西帕尼爾生物科技有限公司生產(chǎn)，10 ml/包，批號(hào)0747-201511），本院淫羊藿苷制劑，色譜純?yōu)橐译妫绹?guó)Tedia公司），水選取注射用水，分析純等。

2 方法

2.1 理化鑒定[2]

檢查黃酮類，準(zhǔn)確稱量藥物粉末0.1 g，加水10 ml，水浴10 min，濾過(guò)蒸干，加乙醇5 ml并熱溶，再次濾過(guò)。濾液中加鎂粉及濃鹽酸，顯紅色。準(zhǔn)確稱量藥物粉末0.5 g入甲醇10 ml，水浴溫浸30 min后濾過(guò)。濾液濃縮至1 ml留備供試品溶液。取淫羊藿苷對(duì)照品，甲醇溶解，制備l～2 mg/1 ml對(duì)照溶液。取2種溶液各10 μl，點(diǎn)于同一硅膠H薄層板，以10：1：1：1配比的醋酸乙酯—丁酮—85%甲酸—水展開，展距為15 cm。取出晾干，置于紫外分析燈（365 nm）下觀察，供試品與對(duì)照品在色譜相應(yīng)位置上呈現(xiàn)相同暗紅斑點(diǎn)。1%AlCl3試液噴霧再次觀察，斑點(diǎn)呈現(xiàn)橙色。

2.2 含量測(cè)定

色譜條件：色譜柱ZorbaxSB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈—水（25：75，V/V），流速設(shè)定：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)的確立：取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加50%乙醇溶液溶解，稀釋至1 mg/ml，50%乙醇溶液作為空白對(duì)照，于200～400 nm波長(zhǎng)范圍中掃描，波長(zhǎng)達(dá)270 nm時(shí)出現(xiàn)最大吸收[3]。計(jì)算理論塔板數(shù)≥2 500。準(zhǔn)確稱量對(duì)照品制備對(duì)照溶液，經(jīng)甲醇溶液溶解制備1 ml溶液，含淫羊藿苷34.5 μg。準(zhǔn)確稱取供試品0.2 g，研細(xì)置于錐形瓶（有塞）中，入50%乙醇溶液20 ml，經(jīng)功率200 W，頻率59 KHz超聲處理45 min，放置至室溫后稱重，不足則以50%乙醇溶液補(bǔ)足。搖勻過(guò)濾后精密量取4 ml水浴蒸干，加水（10 ml）溶解，以乙酸乙脂10 ml萃取3次，減壓回收溶劑至干，以50%乙醇溶液溶解殘?jiān)ㄈ葜?5 ml，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱量淫羊藿苷對(duì)照品10.40 mg，置于50 ml量瓶中，用50%乙醇溶液溶解稀釋成濃度為208.0 μg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別從中準(zhǔn)確抽取 0.6 ml、1.2 ml、1.8 ml、2.4 ml、3.0 ml、3.6 ml的溶液，置于25 ml量瓶中，分別用50%乙醇溶解稀釋，獲得系列濃度的對(duì)照品。準(zhǔn)確抽取對(duì)照品，各濃度各20 μl，注入液相色譜儀，依“2.2”中色譜條件測(cè)定峰面積。以淫羊藿苷進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

3 結(jié)果

根據(jù)方程Y＝-5.953＋2107.944x，r＝0.999 8，提示淫羊藿苷于0.099 84～0.599 04 μg范圍內(nèi)存在良好線性關(guān)系。

3.1 陰性干擾試驗(yàn)

按供試品溶液制備法制備淫羊藿苷陰性對(duì)照品溶液，濃度14.97 μg/ml。準(zhǔn)確抽取淫羊藿苷供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，依“2.2”中色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，淫羊藿苷于陰性無(wú)干擾處。

3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確抽取淫羊藿苷對(duì)照品溶液（濃度14.97 μg/ml）20 μl，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，RSD為1.03%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同供試品溶液20 μl，制備后分別于0、2、4、6、8 h測(cè)定峰面積，RSD為1.39%，測(cè)定所得結(jié)果顯示供試品溶液在8 h內(nèi)其淫羊藿苷穩(wěn)定性均良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份供試品，按同樣方法制備供試品溶液，抽取20 μl溶液，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD為2.92%。

3.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取50 mg淫羊藿藥材粉末，分為6份，分別加入對(duì)照品溶液3個(gè)量各3份，按照供試品制備完成后對(duì)其含量予以測(cè)定，結(jié)果顯示淫羊藿定C及淫羊藿苷回收率分別為99.7%、102.5%，RSD分別為1.4%、1.1%，見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

淫羊藿，小檗科植物莖葉，通常取自淫羊藿、心葉淫羊藿或箭葉淫羊藿，均為野生。少數(shù)附帶取其根莖與須根。別名：羊藿葉、仙靈脾、三枝九葉草。于陜西、四川、湖北及湖南多省的山林地帶[4]。其性溫味辛，歸于肝腎經(jīng)。具強(qiáng)筋骨，補(bǔ)肝腎及祛風(fēng)濕、助陽(yáng)益精之臨床功效。多被施用于腰膝酸軟、風(fēng)寒濕痹、四肢麻木以及男科陽(yáng)痿等病癥。淫羊藿的現(xiàn)代藥理研究顯示該藥：（1）可興奮性機(jī)能：相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，淫羊藿可促精液分泌，尤以葉、根藥效最佳，果實(shí)次之而莖部為最弱。（2）影響血小板凝集：大鼠體外實(shí)驗(yàn)表明，淫羊藿可增加血小板聚集率；另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，淫羊藿中的多糖成分可通過(guò)促進(jìn)血小板的生成，而增強(qiáng)血小板聚集作用[5-7]。（3）降血壓：通過(guò)周圍血管舒張作用而降低血壓。（4）抗病毒：淫羊藿煎劑可直接滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及Sabin Ⅰ型。（5）影響骨代謝：大鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，淫羊藿還可預(yù)防去睪丸大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生。淫羊藿提取液不僅能夠抑制破骨細(xì)胞活性，又可改善骨細(xì)胞功能，使鈣化骨形成增加，骨形成大于骨吸收[8-10]。另外，淫羊藿對(duì)糖皮質(zhì)激素所引起的骨質(zhì)疏松有著良好的預(yù)防作用，聯(lián)用糖皮質(zhì)激素，可顯著抑制糖皮質(zhì)激素對(duì)骨質(zhì)的吸收。（6）對(duì)骨髓及造血系統(tǒng)的作用：研究證實(shí)，EPS可提高DNA合成率，影響核酸代謝，提高體外培養(yǎng)骨髓細(xì)胞增殖率，并能使疊氮胸苷所致的不良反應(yīng)（外圍血白細(xì)胞數(shù)目、骨髓造血干細(xì)胞和粒單系祖細(xì)胞數(shù)量減少，脾淋巴細(xì)胞增殖和產(chǎn)生IL-2能力顯著降低）部分或全部消失[11-12]。提示EPS能促進(jìn)骨髓造血，可試用于白血病的治療。

本研究中就高效液相色譜法測(cè)定供試品淫羊藿苷含量可行性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)論證。結(jié)果顯示供試品淫羊藿苷在0.099 84～0.599 04μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好并無(wú)隱性干擾，供試品溶液8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。且本研究實(shí)驗(yàn)中依照淫羊藿苷溶解性質(zhì)，經(jīng)乙酸乙脂多次提取、純化后可明顯減少供試品溶液中雜質(zhì)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。在使被測(cè)成分完全提取得到保證的同時(shí)降低了樣品對(duì)色譜柱的污染與干擾。此外，在本研究中，以乙腈—水（25：75，V/V）作為淫羊藿藥材含量測(cè)定相中的流動(dòng)相，利于實(shí)驗(yàn)獲得良好色譜分離效果。