兩棲類動物皮膚分泌物的相關(guān)研究

西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 730030 西北民族大學(xué)化工學(xué)院 730030 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 730030

在脊椎動物演化過程中，兩棲類動物是由水生到陸生的過渡型，其中很多物種具有食用或醫(yī)藥保健等價值，因此是重要的生物資源。

兩棲動物的皮膚分泌液中含有大量能夠殺滅微生物、防御天敵的生物胺和活性多肽,其中生物胺與活性多肽的含量之高是哺乳類動物無可比擬的，因而被稱為生物胺與活性多肽的巨大儲存庫。其皮膚分泌液中含有4大類生物化學(xué)成分,即生物胺、蟾蜍配基、生物堿、多肽和蛋白質(zhì)[1]，其中最豐富的是抗菌肽。蛙皮抗菌肽于20世紀(jì)70年代被人們發(fā)現(xiàn)，但是一直沒有受到重視，直至從非洲爪蟾中提取出了蛙皮抗菌肽Magainins族，人們才開始重視對抗菌肽的研究[2]。

1 材料及試劑

（1）實驗動物。非洲爪蟾、蘭州地區(qū)的中國林蛙、中華大蟾蜍及花背蟾蜍。

（2）菌株。大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌和紅色毛廯菌。

（3）溶液和培養(yǎng)基。①SDS-PAGE濃縮膠和分離膠的配制。配制12%分離膠5mL：去離子水1.6mL、30%丙烯酰胺 2.0mL、 1.5%Tris-HCl1.3mL、10%SDS 0.05mL、10%過硫酸銨 0.05mL(現(xiàn)配現(xiàn)用)、TEMED 0.002mL；配制5%濃縮膠2mL:去離子水1.4mL、30%丙 烯 酰 胺 0.33mL、1.0Tris-HCl0.25mL、10%SDS 0.02mL、10%過硫酸銨 (現(xiàn)配現(xiàn)用)0.02mL、TEMED 0.002mL。②液體培養(yǎng)基。NaCl5.0g、胰蛋白胨5.0g、酵母提取物2.5g，加入去離子水500mL，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙猓脻舛葹?mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，120℃高壓滅菌15分鐘。③LB固體培養(yǎng)基。向配制好的500mL液體培養(yǎng)基中加入7.5～10g瓊脂粉，120℃高壓滅菌15分鐘。

2 兩棲類動物皮膚分泌物的提取方法

（1）乙醚刺激。將活體非洲爪蟾、中國林蛙、中華大蟾蜍及花背蟾蜍的皮膚表面用超純水清洗干凈，用酒精棉球擦干凈，然后將其分別放置于1000mL燒杯中，滴加1mL的無水乙醚，蓋住燒杯口，使燒杯密閉，靜置1分鐘。這4種試驗動物均表現(xiàn)狂躁不安，奮力掙扎，最終麻醉昏迷。隨后取出4種試驗動物置于容器中，5分鐘后中國林蛙背部有少量的泡沫狀物質(zhì)分泌出來，非洲爪蟾的背部及后腿部有大量泡沫狀物質(zhì)分泌出來，花背蟾蜍的背部有淡黃色液滴狀物質(zhì)分泌出來，中華大蟾蜍背部皮膚處有泡沫狀物質(zhì)分泌出來，同時非洲爪蟾、中國林蛙、中華大蟾蜍及花背蟾蜍隨著分泌物產(chǎn)生的過程其皮膚顏色漸漸變淺。將提取出來的分泌物收集，保存到-20℃冰箱備用。

（2）腎上腺素刺激。將活體非洲爪蟾、中國林蛙、中華大蟾蜍及花背蟾蜍的皮膚表面用超純水清洗干凈，用酒精棉球擦干凈，分別給4種試驗動物背囊部注射鹽酸腎上腺素0.25mL。注射腎上腺素后非洲爪蟾的后背部立即有大量白色泡沫狀物質(zhì)分泌出來，花背蟾蜍的耳后腺處有淡黃色液滴分泌出來，而背部沒有分泌物，2分鐘后中國林蛙和中華大蟾蜍背部均有少量的泡沫狀物質(zhì)分泌出來，同時非洲爪蟾、中國林蛙及中華大蟾蜍隨著分泌物產(chǎn)生的過程其皮膚顏色漸漸變淺。將提取出來的分泌物收集，保存到-20℃冰箱備用。不同的提取方法適用于不同的兩棲類動物。在提取兩棲類動物皮膚分泌物前，了解該兩棲類動物皮膚屬于哪種類型，最終采用與之匹配的提取方法。

3 皮膚分泌物體外抑菌性觀察

（1）方法。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌和紅色毛廯菌4種細(xì)菌分別接種于液體培養(yǎng)基中，放置于搖床上培養(yǎng)20小時。再將液體培養(yǎng)基中的菌液吸取50μL于含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用涂布棒涂抹均勻。每種菌液涂抹4個培養(yǎng)基，分別標(biāo)記1～4號，再將用乙醚方法刺激分泌的各種皮膚分泌物抗菌肽的粗提物吸取5μL分別滴加至1號培養(yǎng)皿中；將用去甲腎上腺素刺激分泌的各種皮膚分泌物抗菌肽吸取5μL分別滴加至2號培養(yǎng)皿中；3號培養(yǎng)皿中分別滴加5μL滅菌水；4號培養(yǎng)皿作為對照。將上述培養(yǎng)皿置于溫箱中培養(yǎng)12小時和24小時，觀察其抑菌效果。

（2）結(jié)果。見表1和表2。

表1 乙醚方法提取的兩棲動物皮膚分泌物抑菌活性

表2 腎上腺素方法提取的兩棲動物皮膚分泌物抑菌活性

（3）結(jié)論。通過對非洲爪蟾、蘭州地區(qū)的中國林蛙、中華大蟾蜍及花背蟾蜍4種實驗動物皮膚分泌物的體外抑菌作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)非洲爪蟾的抑菌效果相對于其他3種動物更好，并且兩棲類動物皮膚分泌物對細(xì)菌及真菌都有較好的抑菌效果。不同的刺激方法提取出來的抗菌肽粗提物的抑菌效果也有細(xì)微的差異。由于非洲爪蟾皮膚分泌物不僅量多，而且抑菌效果較好，因此對非洲爪蟾皮膚分泌物中抗菌肽需做進(jìn)一步的研究。

4 非洲爪蟾皮膚分泌物SDS-PAGE檢測

（1）SDS-PAGE檢測方法。十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)可根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別分離蛋白質(zhì),并可測定蛋白質(zhì)的相對分子量。經(jīng)制備凝膠、點樣、電泳、染色和脫色后，以Marker為標(biāo)準(zhǔn)，測出非洲爪蟾皮膚分泌物抗菌肽的相對分子量。

（2）結(jié)果。根據(jù)lgMW=K-bx(x為遷移率)可得出非洲爪蟾皮膚分泌物中活性蛋白分子量在20～90KD及小于20KD的小分子多肽。

5 討論

研究發(fā)現(xiàn)，兩棲類動物抵御外來微生物入侵是通過其皮膚分泌的抗菌肽來完成的[3]。試驗通過對兩棲類動物皮膚分泌物提取方法的比較以及抑菌活性的觀察，對非洲爪蟾皮膚分泌物分子量的測定，得出乙醚方法提取分泌物適用于皮膚薄、皮膚腺較為發(fā)達(dá)的兩棲類動物，而且得到分泌物的量較腎上腺素方法的多。腎上腺素方法提取分泌物適用于耳后腺發(fā)達(dá)的兩棲類動物，由此發(fā)現(xiàn)不同的方法適用于不同的兩棲動物物種。

在提取兩棲類動物的皮膚分泌物前，了解該物種的皮膚屬于哪種結(jié)構(gòu)及分泌方式，采取合適的采集方法[4]。非洲爪蟾和中國林蛙皮膚分泌物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及紅色毛廯菌都有抑菌效果，兩棲動物皮膚分泌物對大部分試驗菌株均具有不同程度的抑菌活性[5]。兩棲動物皮膚分泌物中抗菌肽抑菌效果可能作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，細(xì)胞壁一旦被破壞就會引起細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化和細(xì)胞死亡?？赡茏饔糜诩?xì)菌細(xì)胞膜，抗菌肽穿過第一道屏障-細(xì)胞壁后接觸到細(xì)菌細(xì)胞膜，氨基酸殘基與磷脂雙分子在靜電作用下發(fā)生結(jié)合。非洲爪蟾皮膚分泌物活性蛋白分子量大小為20～90KD以及小于20KD的活性多肽，從而推斷出抑制細(xì)菌生長的活性物質(zhì)為抗菌肽。