HPLC法測定壯藥白飯樹中巖白菜素含量

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1.廣西國際壯醫醫院，廣西 南寧 53001；2.廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530022

白飯樹來源于大戟科植物Flueggea virosa(Roxb.ex Willd.)Voigt.的干燥全株，為壯族民間常用藥材[1-3]，多以全株入藥，認為其苦、微澀，涼，有小毒，具有清熱毒、除濕毒之功，用于能唅能累(濕疹)，頭瘡，唄膿顯(膿包瘡)，唄膿(癰腫)，發旺(痹病)。白飯樹在廣西分布于全區各地。文獻記載，從白飯樹的樹葉及嫩枝中分離出巖白菜素、右旋一葉萩堿 、山柰酚、槲皮素、沒食子酸、胡蘿卜苷和β-谷甾醇等[4-5]。其中，巖白菜素具有良好的鎮咳和治療胃腸道疾病如胃潰瘍、腹瀉及便秘的作用以及良好的抗炎、抗心律失常、抗病毒、護肝作用，是本品活性成分之一[6-9]。實驗以巖白菜素為指標成分，建立高效液相色譜法測定白飯樹藥材中巖白菜素含量，用于白飯樹藥材的質量控制，為《廣西壯族自治區壯藥質量標準(第三卷)》收錄白飯樹藥材的質量標準研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260型高效液相色譜儀(帶自動進樣器及VWD檢測器，安捷倫公司)；LC-20AT高效液相色譜儀(自動進樣器、二極管陣列檢測器，島津公司)；UV-2401PC紫外-可見分光光度計(島津公司)；KQ-3200DE型數控超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)；XS205十萬分之一電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；EASYPURE Ⅱ超純水器(美國熱電公司)。

1.2 材料 巖白菜素對照品(批號：111532-201203，純度94.4%，中國食品藥品檢定研究院供)。甲醇、乙腈為色譜純(德國merck公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純。白飯樹藥材采自廣西15個不同產地，來源信息見表1。其中，BFS-1和BFS-8藥材采集了對應帶果臘葉標本，經廣西中醫藥研究院賴茂祥研究員和廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定，均為大戟科植物白飯樹Flueggea virosa(Roxb.ex Willd.)Voigt。

表1 白飯樹樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為依利特SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(15∶85)，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測波長275 nm。

2.2 供試品溶液制備方法的篩選

2.2.1 提取方法的考察 取BFS-2粉末，分別比較超聲和加熱回流兩種提取方法制備的供試液巖白菜素含量。方法為取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，各精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量后，超聲處理30 min，放冷，用甲醇補足減少的重量，過濾，取續濾液，作為供試品溶液；方法與上述類似，但超聲處理改為水浴加熱回流。分別精密吸取上述供試品溶液和對照品溶液5 mL進樣測定巖白菜素含量。結果，上述兩種提取方法制備的供試品溶液巖白菜素含量相同(均為0.68%)。從操作簡便考慮，選擇超聲提取的方法。

2.2.2 供試品溶液制備方法的條件優化 采用正交設計方法，對超聲提取的藥材破碎度、甲醇濃度、提取時間等三因素三水平進行考察，見表2。以巖白菜素的含量為考核指標，采用L9(34)正交設計表安排試驗，結果見3和表4。

表2 正交試驗因素水平表

表3 正交試驗與結果

表4 方差分析

注:F0.05(2，2)=19，F0.01(2，2)=99

由表2和表3可知，影響巖白菜素得率的因素大小順序為：藥材破碎度>甲醇濃度>提取時間，藥材破碎度對實驗結果影響有一般顯著性差異，其余因素對實驗結果影響無顯著性差異。綜合考慮，確定最佳提取條件為A3B1C1。

2.3 對照品、供試品和陰性溶液制備 取巖白菜素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為60 μg/mL的溶液，作為對照品溶液；取本品粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞,稱定重量, 超聲處理(功率150 W，頻率40 KHZ)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。以甲醇溶液作為陰性對照溶液。

2.4 專屬性試驗 取上述三種溶液各5 mL，照2.1項條件進樣測定。結果：供試品溶液的色譜圖中均有與巖白菜素保留時間相同的吸收峰，陰性溶液的色譜圖則無此吸收峰。說明用本方法測定巖白菜素含量無陰性干擾，專屬性強。見圖1。

2.5 線性關系考察 精密稱取巖白菜素對照品16.1 mg(純度為94.4%)，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。分別精密吸取以上對照品溶液0.15、1、2、3、4、5 mL分別置于5 mL量瓶中，各加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品稀釋溶液各5 mL，照2.1項色譜條件進樣測定，以對照品的進樣量(μg)為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線。結果：巖白菜素進樣量在0.045 6-1.519 μg范圍內，進樣量與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為：Y=1543.1X-8.003 7(r=0.999 9)。

2.6 精密度試驗

2.6.1 重復性 取同一份供試品溶液(BFS-2)，照2.1項色譜條件連續進樣測定6次。結果：6次測定巖白菜素峰面積分別為910.1、902.1、903.1、897.5、899.4、894.6，平均值為901.1，RSD=0.60%(n=6)。

2.6.2 重現性 取白飯樹藥材(BFS-2)粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，照2.3.1項方法平行制備6份供試品溶液，照2.1項色譜條件進樣測定。結果：6份供試品溶液測得巖白菜素含量分別為0.68%、0.68%、0.68%、0.70%、0.70%、0.69%，平均值為0.69%，RSD=2.04%(n=6)。

2.7 穩定性試驗 取白飯樹藥材同一供試品溶液(BFS-2)，分別于0、2、4、6、12和24 h各進樣測定。結果：24 h內6次測得的巖白菜素含量分別為0.66%、0.67%、0.68%、0.67%、0.67%、0.67%，平均值為0.67%，RSD為1.19%(n=6)。

2.8 加樣回收率試驗 分別精密稱取已知含量的樣品粉末(BFS-2)0.25 g共6份，精密稱定，各加入巖白菜素對照品的甲醇溶液(72.8 μg/mL)25 mL，照2.2項方法制備供試品溶液，并照2.1項色譜條件測定巖白菜素含量，計算平均回收率及RSD。結果：巖白菜素含量平均回收率為102.6%，RSD=2.09% (n=6)。見表5。

表5 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.9 儀器最低檢出限 取巖白菜素對照品甲醇溶液進行稀釋，計算信噪比S/N=3及信噪比S/N=10時注入儀器的量。結果：巖白菜素對照品的最低檢出限為0.9 ng，最低定量限度為2.28 ng。

2.10 耐用性試驗 分別采用依利特SinoChrom ODS-BP、Aglient 5 TC C18柱和Phenomenex Gmini C18(規格均為4.6 mm×250 mm，5 μm)3根不同品牌色譜柱，測定樣品(BFS-2)中巖白菜素的含量。結果：3根色譜柱測定巖白菜素平均值為0.60%，RSD=1.73%(n=3)；分別采用安捷倫1260型和島津LC-20AT 2臺不同品牌的色譜儀，測定樣品(BFS-2)中巖白菜素含量。結果：2臺色譜儀測定巖白菜素平均值為0.61%，RAD=0.91% (n=2)。表明不同品牌色譜柱和不同品牌高效液相色譜儀對本法測定結果影響不大。

2.11 樣品測定 取上述1.2項巖白菜素對照品和15批藥材樣品，照2.2項方法制備對照品溶液和供試品溶液，照2.1項色譜條件測定，按藥材干燥品計算含量。結果：15批樣品巖白菜素含量為0.096%～1.43%。結果見表6。

表6 15批白飯樹中巖白菜素含量測定結果 (n=2)

3 討論

3.1 色譜柱的選擇 在其它色譜條件相同的情況下，分別采用依利特SinoChrom ODS-BP、Aglien 5 TC C18和Phenomenex Gemini C18(規格均為4.6 mm×250 mm，5 μm)三根色譜柱測定樣品(1號)。結果上述三根色譜柱均可得到良好的分離效果。本文選擇依利特SinoChrom ODS-BP作為色譜柱。

3.2 流動相的選擇 在其它色譜條件相同的情況下，對甲醇-水(15∶85)、甲醇-水(18∶82)以及乙腈-水(15∶85)三個流動相系統，以及0.8 mL/min、1.0 mL/min和1.2 mL/min三個流速進行考察，結果：甲醇-水(15∶85)的流動相系統分離效果較好，三種流速巖白菜素均可得到良好的分離效果，本文選用1.0 mL/min的流速。

3.3 波長選擇 采用島津UV-2401PC紫外-可見分光光度計對巖白菜素色譜峰在200～600 nm范圍內進行紫外光譜掃描。巖白菜素在210 nm、275 nm波長有較大吸收，因實驗過程中流動相的甲醇在220 nm波長時有干擾，故確定檢測波長為275 nm。

3.4 實驗過程中，比較過甲醇和乙醇兩種不同溶劑提取白飯樹中巖白菜素得率，結果用乙醇提取的樣品注入色譜儀測定后，色譜分離效果不佳，故最終采用甲醇提取法。

綜上，本法測定白飯樹中巖白菜素的含量，樣品提取方式簡單，且無其他成分干擾；方法學研究表明，該測定方法穩定，重現性好，準確度高，分離度好，為白飯樹藥材的質量控制提供了科學依據。目前，本含量測定方法已收入《廣西壯族自治區壯藥質量標準(第三卷)》“白飯樹”項下，作為該藥材生產、流通、使用和檢驗的依據。