緩釋FGF2基因殼聚糖核殼微球提高顆粒脂肪移植存活率的研究

馬莉 蔣思靜 賈大平 趙宇

顆粒脂肪是目前臨床首選的填充移植物，但存在吸收率高、感染及液化等并發癥。研究表明，在顆粒脂肪移植過程中添加FGF2可誘導脂肪干細胞向血管內皮細胞分化，以促進新生血管形成，提高顆粒脂肪移植存活率[1]，但是單獨添加FGF2易被組織稀釋，存留時間短，成本高，難以長期發揮作用[2]，而FGF2基因治療技術更具有實際應用價值。病毒與脂質體由于具有細胞毒性和致畸性等潛在風險限制了其臨床應用。殼聚糖具有緩釋、基因載體等多種功能并廣泛應用于藥物緩釋劑基因載體的研究。我們前期研究顯示，殼聚糖衍生物巰基烷基化殼聚糖（Thiolated N-alkylated chitosan）可與DNA通過正負電荷相互作用形成包載基因的核結構 （TACS-pEGFP），核結構具轉染特性。核結構再與羥丁基殼聚糖（HBC）形成核殼結構（HBC@TACS-pEGFP）。該核殼結構基因載體具有低細胞毒性、良好的轉染效率和緩慢釋放基因等特點[3]。因此，我們設想在顆粒脂肪移植過程中添加包埋FGF2基因的緩釋轉染核殼結構，以提高顆粒脂肪移植存活率。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

新西蘭兔18只，3月齡，體質量2.5～3.0 Kg，雌雄不限（安徽醫科大學動物實驗中心）；人腎上皮細胞（293T細胞）（安徽醫科大學免疫教研室）；巰基烷基化羥丁基殼聚糖（TACS）及羥丁基殼聚糖（HBC）（中國科學技術大學材料與化學研究實驗室）；兔源性融合基因pFGF2-EGFP大腸桿菌菌株和空載質粒 GV219（上海吉凱生物公司）；DMEM培養基（Gibco公司，美國）；兔抗 CD31 抗體（Sigma公司，美國）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼結構轉染載體的制備

體外擴增提取質粒，測定質粒濃度后，-20℃保存備用。按照課題組前期研究結果，以20∶1的氮磷比，將TACS與pFGF2-EGFP質粒混合于PBS緩沖液中，渦旋振蕩30 sec，混勻，室溫下靜置30 min，形成TACS-pFGF2-EGFP質粒核結構，再加入與TACS等量的HBC，渦旋振蕩30 sec，混勻，室溫下靜置30 min，即可形成HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼結構[3]。

1.3 核殼結構體外降解釋放pFGF2-EGFP實驗

分別制備含 100 μg質粒的 TACS-pFGF2-EGFP和HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼結構置于透析袋中，將透析袋置于含TE緩沖液中，分別于第1、2、3、5、8、10、15、20 天時測定緩沖液中 pFGF2-EGFP的濃度。檢測核殼結構包載基因相較于核結構包載基因緩釋基因的釋放規律。

1.4 Western-blot檢測體外轉染細胞表達FGF2蛋白的水平

體外培養人293T細胞，細胞融合達80%～90%時進行轉染。對照組：每培養皿中加入含5 μg空載質粒（GV219）的HBC@TACS-GV219核殼結構及不含血清的培養基進行轉染。實驗組：每培養皿中加入含5 μg質粒的HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼轉染載體及不含血清的培養基進行轉染實驗。分別于轉染第2天及第4天時收集細胞，Western-blot檢測各組體外轉染細胞表達FGF2蛋白的情況。

1.5 顆粒脂肪移植實驗

新西蘭兔靜脈麻醉，無菌條件下切取肩胛間區脂肪，剪碎至約1 mm3大小備用。將兔耳皮膚與耳軟骨膜剝離，形成直徑約3 cm的皮下腔隙作為顆粒脂肪移植受區。兔左耳作為實驗組，移植2 mL脂肪顆粒和HBC@TACS-pFGF2-EGFP；兔右耳作為對照組，移植2 mL脂肪顆粒和HBC@TACS-空載質粒。每組均含質粒 20 μg，體積 200 μL。術畢，縫合皮膚，肌肉注射青霉素預防術后感染，單籠飼養。分別于術后4、8、12周取材觀察大體標本，測量組織體積，行HE染色及免疫組化染色，觀察移植脂肪的成活情況及新生血管情況。

1.6 觀察指標

一般觀察：術后動物活動及飲食情況，移植后取材區及移植區有無感染等情況。移植物大體觀察：分別于術后第4、8、12周取材，觀察耳部移植物大體組織形態，計算移植后不同時間點的組織存活率。HE染色：觀察移植物脂肪細胞形態及新生血管情況。免疫組化：羊抗兔CD31抗體染色，測量平均光密度值，計算新生血管密度。

1.7 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。術后組織體積數據以（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 核殼結構體外緩釋pFGF2-EGFP質粒

TACS-pFGF2在TE緩沖溶液中緩釋24 h后其釋放率約為45.3%，緩釋48 h時釋放率約為59%；第5天時，約有86.3%的pFGF2-EGFP被釋放；第10天到第20天時，TACS-pFGF2-EGFP組的基因釋放率無明顯增高，均在90%左右。而HBC@TACS-pFGF2-EGFP組在各時間點釋放的基因濃度均低于TACS組。由此可見，TACS在包裹基因后能在短時間內釋放基因，而在TACS外繼續包裹HBC后增加了載體的降解時間，減緩了基因釋放的速度（圖1）。

圖1 核殼結構納米粒子體外緩釋實驗Fig.1The release of TACS-pFGF2-EGFP and HBC@TACS-pFGF2-EGFP in the TE buffer in vitro

2.2 HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼結構體外轉染細胞表達FGF2蛋白的情況

實驗組HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼緩釋基因載體在體外可成功轉染細胞并表達FGF2蛋白，且隨時間增加表達蛋白的量也在增加（P＜0.01）。轉染后第4天時，實驗組FGF2蛋白表達水平顯著高于對照組（P＜0.05）。說明 HBC@TACS-pFGF2-EGFP核殼結構基因載體可成功轉染細胞并表達目的蛋白FGF2，且隨時間推移蛋白表達水平逐漸增加（圖2）。

圖2 體外轉染細胞后不同時間點FGF2蛋白表達情況Fig.2 Expression of FGF2 at different time point after transfection

2.3 不同時間點移植物大體觀察

實驗組脂肪體積在不同時間點均大于對照組。移植術后第4周，實驗組和對照組的脂肪組織仍呈顆粒狀，脂肪顆粒顏色稍蒼白、缺血明顯、無明顯包膜形成，對照組移植物中央可見少量脂肪無菌性液化。術后第8周時，兩組顆粒脂肪移植物體積與第4周相比有所減小，大體結構與正常組織相似，組織顏色淡黃色，質地柔軟，未感染或囊性液化。第12周時，兩組脂肪組織可見完整包膜及大量新生血管，組織體積近一步減小，形態與正常組織無異（圖3）。

圖3 不同時間點取材大體標本觀察Fig.3 Gross observation of fat harvested at different time point

2.4 不同時間點脂肪體積的測定

結果顯示，隨移植時間的延長，實驗組4、8、12周時的脂肪移植存活率分別為 （89.50±1.86）%、（79.94±1.61）%和 （75.98±2.66）%；對照組分別為（72.56±1.90）%、（64.54±3.58）%和 （57.98±4.84）%，各時間點間差異顯著（P＜0.05），且實驗組脂肪移植存活率在各時間點均大于對照組（P＜0.05）。

2.5 HE染色

術后第4周時，脂肪組織可見少量纖維包裹，實驗組脂肪排列稍整齊，邊緣區及中央區開始出現少量新生血管；對照組脂肪細胞大小不一，排列紊亂，少量炎癥細胞浸潤，并有纖維條索形成。術后第8周，實驗組脂肪細胞排列逐漸整齊，新生血管進一步增多；對照組脂肪組織可見少量空泡，纖維條索進一步取代脂肪組織。術后第12周，實驗組脂肪組織形態與術后第8周相比無明顯變化，組織形態與正常脂肪組織差別不大，并可見大量成熟血管；對照組脂肪組織內見大量纖維條索結構形成（圖4）。

圖4 不同時間點取材脂肪組織HE染色（100×）Fig.4 Histological observation of adipose tissue at different time point by HE staining(100×)

2.6 免疫組化觀察

移植術后第4周，實驗組即可觀察到少量CD31蛋白被染成棕色，對照組棕色顯色不明顯。術后第8周和12周，實驗組棕色染色逐漸增多。對照組也可觀察到少量棕色顯色。Image J軟件測定CD31光密度，術后各時間點實驗組脂肪組織的CD31平均光密度值均高于對照組（P＜0.05），且隨時間推移CD31的光密度值逐漸增高，說明移植術后各取材時間點的實驗組脂肪組織的新生血管密度均高于對照組（圖 5、6）。

圖5 不同時間點取材脂肪組織免疫組織化學染色分析（200×）Fig.5 Histological and immunohistochemical analysis of adipose tissue at different time point by IHC(200×)

圖6 不同時間點取材脂肪組織CD31平均光密度值分析Fig.6 The average optical density of CD31of adipose tissue at different time point

3 討論

脂肪移植已成為整形外科的重要部分，但脂肪移植后難以維持其移植時的初體積。Kolle等[4]研究表明，移植后的高吸收率從25%～80%不等。由于脂肪細胞對缺血的耐受性較低，導致部分顆粒脂肪無菌性壞死吸收。脂肪組織的緩慢血運化導致早期細胞凋亡和成熟移植脂肪細胞壞死。即使移植后再血管化，移植物體積縮小過程仍然存在。

bFGF可促進脂肪干細胞成脂分化和成血管分化，被廣泛用于促進脂肪移植存活率的研究[1]。但外源性生物蛋白制劑在進入體內環境后易被組織中的酶代謝降解，無法長期發揮作用[1]。殼聚糖作為一種天然、低毒性的基因轉染材料被廣泛應用[5]。本課題組前期成功制備了可作為基因載體的巰基烷基化殼聚糖（TACS），在TACS的量與基因的量比例為20∶1時轉染效率最高，可達38.99%。我們還制備了具有溫度敏感效應的羥丁基殼聚糖 （HBC）包裹基因載體，達到緩釋基因載體的功效。與傳統的基因載體（如Lip2000等）相比，改性后的殼聚糖作為轉染載體能完整包裹基因，具有良好的生物相容性和低細胞毒性[3]。

有研究利用巰基烷基化殼聚糖（TACS）和羥丁基殼聚糖 （HBC）依次包裹 BMP4基因，制成HBC@TACS-pBMP4核殼緩釋轉染載體，用于修復骨缺損，結果提示在骨缺損修復過程中，BMP4蛋白持續表達，促進了骨缺損的修復，并且新生骨具有一定的生物力學特性[6]。說明該核殼緩釋基因載體適用于長期治療過程。

本實驗同樣證實了HBC@TACS-pFGF2-EGFP在體外可緩慢降解釋放pFGF2-EGFP基因，而且在轉染細胞后可成功表達FGF2蛋白。在脂肪移植實驗中，實驗組加入了HBC@TACS-pFGF2-EGFP緩釋轉染微球。在術后取材進行脂肪移植存活率計算中發現，實驗組脂肪移植存活率在各時間點均大于對照組。HE染色觀察發現，實驗組脂肪結構與正常脂肪相似，對照組脂肪吸收率較高，且被部分纖維組織取代。免疫組織化學分析顯示，實驗組可見較多被染成棕色的CD31。由此可見，在顆粒脂肪移植過程中添加含有一定量的緩釋FGF2基因的微球，可長時間持續表達FGF2蛋白，并且促進新生血管的形成，降低顆粒脂肪移植過程中的吸收率，提高顆粒脂肪移植存活率。

本實驗在脂肪移植過程中加入pFGF2-EGFP質粒，結果提示脂肪組織存活率較對照組有所提高，CD31的表達也顯著增加，由于加入的基因是融合基因，使得所加入的pFGF2基因的量不明確。需要進一步實驗將EGPF基因切除后探索在移植過程中加入質粒進行輔助，以提高脂肪存活率的最佳的脂肪體積與基因的比值。基因轉染載體TACS外包被了HBC后可延緩基因作用時間，如何確定外層HBC的量，使得基因載體釋放速度與脂肪組織移植后所需蛋白的時效進行匹配仍需進一步研究。此外，本研究中移植物最長取材時間為12周，移植后脂肪組織的遠期轉歸及生物學效應仍需探索。能否使用該方法進一步研究大體脂肪組織的構建也需要進一步的實驗論證。