添加谷氨酰胺對(duì)施氏鱘胚胎發(fā)育及各發(fā)育期抗氧化生化指標(biāo)的影響

謝先中 ，陳曉武 ，冉光鑫 ，楊斌 ，王永樹(shù)

（1.貴州省黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 興義 562400；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

施氏鱘Acipenser schrenckii是中國(guó)現(xiàn)存鱘中最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的優(yōu)質(zhì)珍稀魚(yú)類，在黑龍江、烏蘇里江、松花江等均有廣泛分布。鱘卵徑較大，對(duì)孵化條件要求較高，溫度過(guò)高、缺氧、pH變化等條件下易出現(xiàn)滯育死亡。近年來(lái)，隨著施氏鱘人工養(yǎng)殖技術(shù)和規(guī)模發(fā)展迅速，高質(zhì)量苗種的供不應(yīng)求已成為制約施氏鱘養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[1-3]。

胚胎發(fā)育期是水產(chǎn)動(dòng)物生命過(guò)程中對(duì)外界環(huán)境最敏感的時(shí)期，也是高死亡率的階段。研究表明，在水體中添加維生素、糖類和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)因子可提高水產(chǎn)動(dòng)物胚胎的孵化率、成活率。熊鏵龍等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在普安銀鯽孵化水體中添加30mg/L維生素C能縮短胚胎孵化時(shí)間（提前4.4h出膜），提高胚胎孵化率16.2%，提高仔魚(yú)成活率17.8%。薛凌展[5]對(duì)櫛孔扇貝的研究結(jié)果表明，2μmol/L的維生素C、2.5μmol/L 谷 氨 酸 、40μmol/L 谷 氨 酰 胺（Gln）、10μmol/L牛磺酸等能夠顯著提高櫛孔扇貝的孵化率，降低幼蟲(chóng)滯育率[5]。

Gln為組成生物體蛋白質(zhì)的特殊游離氨基酸，是核酸、核苷酸、氨基糖和蛋白質(zhì)的重要前體，參與動(dòng)物體內(nèi)谷胱甘肽的合成，能清除自由基和抗氧化損傷，提高胚胎免疫功能和抗逆性[6,7]。李光鵬等[8]發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中加入適量的谷氨酰胺可以使其順利通過(guò)阻滯期。陳巨星等[9]在研究鮭Oncorhynchus胚胎細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝時(shí)也發(fā)現(xiàn)，低濃度的谷氨酰胺可以促進(jìn)胚胎發(fā)育。基于Gln的重要作用，本文通過(guò)研究在孵化水體中添加Gln對(duì)施氏鱘胚胎發(fā)育孵化時(shí)間、孵化率、畸形率、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）活力、過(guò)氧化氫酶（CAT）活力及丙二醛（MDA）含量的影響，以期為添加外源Gln促進(jìn)施氏鱘胚胎發(fā)育及抗逆性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雄施氏鱘親魚(yú)體質(zhì)量15kg，雌親魚(yú)43kg，人工注射LRHA催熟，剖腹取卵，干法人工授精后的魚(yú)卵用滑石粉脫粘，放入控溫的水族箱中孵化。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及孵化

采用索萊寶生物有限公司Gln樣品（純度98.5%），按孵化溶液體積加入不同質(zhì)量Gln，分別調(diào)整孵化液中 Gln濃度為 1.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L和10mg/L，未添加Gln為對(duì)照組。每個(gè)孵化箱設(shè)3個(gè)平行孵化框，每個(gè)孵化框中200～300粒受精卵。孵化用水由水質(zhì)凈化系統(tǒng)自動(dòng)凈化，不需換水，孵化水溫為20℃，水流量為600L/h，溶氧保持在7.5mg/L以上。觀察統(tǒng)計(jì)施氏鱘孵化時(shí)間、總孵化率、畸形率等。

孵化時(shí)間（h）為50%胚胎發(fā)育到仔魚(yú)出膜時(shí)間間隔；

總孵化率（%）=出膜仔魚(yú)總數(shù)（直到全部胚胎孵出仔魚(yú)或中途死亡為止）/胚胎總數(shù)×100%；

畸形率（%）=畸形仔魚(yú)數(shù)/出膜仔魚(yú)總數(shù)×100%。

1.2.2 生化指標(biāo)的測(cè)定

各試驗(yàn)組分別取原腸期、心跳期、出膜前期胚胎20個(gè)，將胚胎樣品加入3倍體積的PBS緩沖液，4℃下冰浴勻漿5min，3 000r/min離心10min，取其上清液用于測(cè)定。總蛋白濃度用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。GSH含量、SOD酶活力、CAT酶活力和MDA含量用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示，用Microsoft Excel 2007和SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加Gln對(duì)施氏鱘胚胎孵化的影響

由表1可知，添加Gln能促進(jìn)施氏鱘胚胎發(fā)育孵化。1.0～10.0mg/L Gln各添加組施氏鱘仔魚(yú)出膜時(shí)間逐漸降低，孵化時(shí)間縮短幅度為2.1～8.7h。添加Gln同時(shí)顯著提高了施氏鱘胚胎的總孵化率，降低了畸形率。Gln各添加組的總孵化率提高幅度為3.50%～11.86%，畸形率下降幅度為-51.90%～-12.66%。

表1 添加Gln對(duì)施氏鱘胚胎孵化的影響（%）Tab.1 Effect of Gln addition on hatching of Acipenser schrenckii（%）

2.2 添加Gln對(duì)施氏鱘胚胎GSH含量的影響

由表2可知，添加Gln將增加施氏鱘胚胎各發(fā)育期GSH含量。原腸期，Gln各添加組胚胎體內(nèi)GSH含量提高幅度為4.52%～11.30%。心跳期，Gln各添加組胚胎體內(nèi)GSH含量提高幅度為13.68%～21.37%。出膜前期，Gln各添加組胚胎體內(nèi)GSH含量提高幅度為11.39%～18.81%。

2.3 添加Gln對(duì)施氏鱘胚胎SOD酶活力的影響

由表3可知，添加Gln同時(shí)將增強(qiáng)施氏鱘胚胎各發(fā)育期SOD酶活力。原腸期，Gln各添加組胚胎體內(nèi)SOD酶活力提高幅度為2.72%～6.52%。心跳期，Gln各添加組胚胎體內(nèi)SOD酶活力提高幅度為9.20%～18.39%。出膜前期，Gln各添加組胚胎體內(nèi)SOD酶活力提高幅度為10.89%～17.82%。

表2 添加Gln對(duì)施氏鱘胚胎GSH含量的影響（μmol/g prot）Tab.2 Effect of Gln addition on GSH level in fertilized eggs of Acipenser schrenckii

表3 添加Gln對(duì)施氏鱘胚胎SOD酶活力的影響（U/mg prot）Tab.3 Changes in SOD activity in fertilized eggs of Acipenser schrenckii exposed to Gln

2.4 添加Gln對(duì)施氏鱘胚胎CAT酶活力的影響

由表4可知，添加Gln同時(shí)將增強(qiáng)施氏鱘胚胎各發(fā)育期CAT酶活力。原腸期，Gln各添加組胚胎體內(nèi)CAT酶活力提高不明顯。心跳期，Gln各添加組胚胎體內(nèi)CAT酶活力提高幅度為4.27%～9.40%。出膜前期，Gln各添加組胚胎體內(nèi)CAT酶活力提高幅度為6.61%～12.06%。

表4 添加Gln對(duì)施氏鱘胚胎CAT酶活力的影響（U/mg prot）Tab.4 Changes in CAT activity in fertilized eggs of Acipenser schrenckii exposed to Gln

2.5 添加Gln對(duì)施氏鱘胚胎MDA含量的影響

由表5可知，添加Gln將降低施氏鱘胚胎各發(fā)育期MDA含量。原腸期，Gln各添加組胚胎體內(nèi)MDA含量降低幅度為-7.69%～-15.38%。心跳期，Gln各添加組胚胎體內(nèi)MDA含量降低幅度為-10.00%～-30.00%。出膜前期，Gln各添加組胚胎體內(nèi)MDA含量降低幅度為為-19.23%～-26.92%。添加Gln后，施氏鱘胚胎發(fā)育各期MDA含量與GSH含量、SOD酶活力、CAT酶活力變化趨勢(shì)相反。

表5 添加Gln對(duì)施氏鱘胚胎發(fā)育中MDA含量的影響（nmol/mg prot）Tab.5 Effect of Gln addition on MDA level in fertilized eggs of Acipenser schrenckii

3 討論

本研究表明Gln添加能明顯促進(jìn)施氏鱘胚胎的發(fā)育和孵化效果。Gln添加濃度為1.0～5.0mg/L時(shí)，孵化時(shí)間縮短幅度為2.1～8.7h。總孵化率提高幅度為3.50%～11.86%，畸形率下降幅度為-51.90%～-12.66%。研究同時(shí)表明Gln添加能提高施氏鱘胚胎的抗氧化水平。本研究中1.0～5.0mg/L Gln添加，不同幅度增加了施氏鱘胚胎各發(fā)育期GSH含量、SOD酶活力、CAT酶活力和降低MDA含量。

已有的研究表明，隨著魚(yú)類早期發(fā)育的不斷進(jìn)行，其耗氧率逐漸增加，其代謝強(qiáng)度也在不斷增加，代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧（ROS）會(huì)逐漸增多，如不及時(shí)清除將會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生損傷，進(jìn)而影響到胚胎的發(fā)育[10-12]。Gln添加提高施氏鱘胚胎的抗氧化水平的提高可能與促進(jìn)施氏鱘胚胎發(fā)育有密切關(guān)系。抗氧化能力水平增強(qiáng)，可降低胚胎的氧化損傷，使胚胎發(fā)育處于健康的發(fā)育狀態(tài)，從而促進(jìn)施氏鱘胚胎的發(fā)育、提高總孵化率和降低畸形率。

ROS是需氧生物生命活動(dòng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物及其衍生的含氧物質(zhì)。大量產(chǎn)生的ROS會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等大分子物質(zhì)產(chǎn)生氧化損傷，正常的機(jī)體內(nèi)，ROS會(huì)被抗氧化體系所降解以維持機(jī)體的健康狀態(tài)。這一抗氧化系統(tǒng)內(nèi)包括有GSH、SOD、CAT等。GSH是具有重要生化性質(zhì)的硫醇三肽物質(zhì)，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)合成、DNA復(fù)制和修復(fù)、細(xì)胞增殖等過(guò)程[13-15]。GSH分子中的活潑巰基（-SH），易被氧化脫氫，這使其成為體內(nèi)主要的自由基清除劑。SOD是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)兩種重要抗氧化活性酶，對(duì)機(jī)體抵御氧化損傷起到重要的保護(hù)作用。SOD是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，它可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2。而CAT的主要作用是催化H2O2分解為H2O與O2，使得H2O2不致于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的-OH[13-15]。Gln添加提高施氏鱘抗氧化水平，其作用機(jī)理可能重要來(lái)自于兩個(gè)方面，一方面通過(guò)合成GSH而發(fā)揮直接的抗氧化作用。另一方面Gln添加可能間接通過(guò)提高SOD、CAT等其他抗氧化酶類的活性，從而增強(qiáng)胚胎抗氧化水平。

本研究為了說(shuō)明Gln添加對(duì)抗氧化水平的影響，測(cè)定了施氏鱘胚胎各發(fā)育期MDA含量。MDA是氧自由基攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸引發(fā)最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷，MDA的測(cè)定常常與SOD的測(cè)定互相配合，SOD酶活力的高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。因此，結(jié)合GSH含量、SOD酶活力、CAT酶活力及MDA含量4個(gè)指標(biāo)可以全面了解Gln添加對(duì)施氏鱘抗氧化水平的變化情況[13-15]。

Gln添加對(duì)施氏鱘胚胎發(fā)育前期和后期的抗氧化生化指標(biāo)的影響差異非常明顯，Gln添加對(duì)施氏鱘原腸期胚胎GSH含量、SOD酶活力、CAT酶活力和MDA含量變化幅度較小，而心跳期和出膜前期，GSH含量、SOD酶活力、CAT酶活力和MDA含量變化幅度較大。這可能與施氏鱘胚胎發(fā)育前期抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)育還不完善有關(guān)，施氏鱘原腸期胚胎表達(dá)合成GSH、SOD、CAT的能力較弱，而在后期抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)育逐漸發(fā)育完善，表達(dá)合成能力增強(qiáng)。

趙峰等[16]研究表明，水體鹽度升高將對(duì)施氏鱘幼魚(yú)不同組織抗氧化酶產(chǎn)生影響。本研究中，Gln添加濃度大于10mg/L時(shí)，施氏鱘胚胎也呈現(xiàn)總孵化率下降、畸形率升高、抗氧化酶下降和MDA含量升高的趨勢(shì)。本研究所設(shè)的Gln添加量中，5.0mg/L處理的孵化時(shí)間最短、總孵化率最高、畸形率最低，各發(fā)育期GSH含量最高、SOD和CAT酶活力最高、MDA含量最低。因此，5.0mg/L為Gln應(yīng)用于施氏鱘胚胎孵化的最佳添加量。