利用AFLP技術檢測外源總DNA導入鯽的研究

閆學春，欒培賢，何立川

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，淡水魚類育種國家地方聯合工程實驗室，淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

關于外源總DNA的導入技術在動植物改良和新品種創建方面，已有一些研究。Guangyu-zhou[1]將外源總DNA導入棉花Gossypium spp和水稻Oryza sativa、Oryza glaberrima中改變了它們的遺傳性狀；丁明忠等[2]將大豆 Glycine max（Linn.）Merr總 DNA直接導入玉米Zea mays Linn.sp.中獲得優質高蛋白玉米；胡文明等[3]將玉米的總DNA導入小麥Triticum aestivum L.中，提供了新的種質資源，有利解決小麥遺傳基礎狹窄問題；王德興等[4]將小麥總DNA導入向日葵Helianthus annuus選育自交系中，獲得了品質優良的新品種；閆學春等[5-7]利用顯微介導遠緣雜交技術分別將中國對蝦Fenneropenaeus chinensis和河蟹Eriocheir sinens總DNA導入鯉Cyprinus carpio L.、鏡鯉 Cyprinus carpio L.mirror中，分別獲得了顯微介導中國對蝦基因鯉和顯微介導河蟹基因鏡鯉新品系；劉漢勤等[8]將鯽基因組DNA導入紅鯉 Cyprinus flammans（Richardson）的受精卵內，成功構建了轉基因鯉新個體；梁明山等[9]將胡子鲇Clarias fuscus總DNA導入長吻Leiocassis longirostris中，使轉基因長吻得到了胡子鲇Osteichthyes、Siluriformes、Clariidae 的優良性狀；向建國等[10]將鯉Cyprinuscarpio總DNA片段成功導入草魚Ctenopharyngodon idellus受精卵中，使轉基因草魚獲得了鯉的一部分遺傳性狀；朱新平等[11]成功將鯉基因組DNA導入鯪Cirrhina molitorella受精卵內，對鯪進行了遺傳改良，提高了鯪的耐寒性。

鯽Carassius auratus是我國傳統的鯉科淡水養殖魚類，具有易繁殖、養殖周期短等優點。鱖Siniperca chuatsi（又名桂花魚等）肉質細嫩，味道鮮美，營養豐富，具有優良的遺傳資源，利用顯微介導遠緣雜交技術，將鱖的基因組DNA導入鯽中，以改善鯽肉質的可口程度。本研究將親緣關系較遠的鱖Siniperca chuatsi基因組DNA導入受體鯽中，通過擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphism,AFLP）的檢測，目的是想要了解外源總DNA直接導入鯽是否有與導入鯉有同樣的效果，能否將這些有益的營養特性導入鯽，創造出新的鯽品種。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

試驗用鱖購自哈爾濱市水產市場；試驗用鯽取自黑龍江水產研究所呼蘭試驗站。由黑龍江水產研究所遺傳育種與生物技術研究室制備顯微介導鱖基因鯽。

1.1.2 引物與試劑

DL2000（DNA Marker）購自大連寶生物工程（大連）有限公司，Taq酶和T4 DNA連接酶購自上海生工生物技術服務有限公司，尿素、AFLP接頭和引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。AFLP接頭及引物序列見表1。

1.1.3 鱖總DNA的制備

采用一次性無菌注射器在鱖的尾部提取血液0.1～0.2mL，其中加入 20～30μL到含有 800μL裂解液的離心管中，反復顛倒至混合均勻為止。55℃水浴消化，待組織完全裂解后取出。加入2倍的酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1混合液抽提2次，然后加入RNA酶（終濃度為 20μg/mL）37℃保溫 30min，再加入等體積的氯仿∶異戊醇=24∶1混合液抽提1次。最后加入2倍體積的冷凍無水乙醇沉淀，再用70%的冷凍無水乙醇洗滌沉淀1次，自然干燥后加入1/10 TE （Tris-HCl 0.02M，EDTA 0.02M，pH=8.0）溶解。再用物理方法打斷大片段DNA，將樣品DNA稀釋至終濃度為200ng/μL，-20℃保存備用。

表1 AFLP接頭及引物序列Tab.1 Adapter of AFLP and Primer sequence

1.1.4 顯微介導鱖基因鯽DNA提取

試驗魚DNA提取參見閆學春等[12]，剪取鰭條，放入裂解液中，55℃消化，酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混合液抽提，無水乙醇沉淀，TE溶解，4℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 顯微注射

在當年的4—6月鯽的繁殖期，選性成熟的親魚，經人工催產后，采集其質量高的卵子和精液。為有效利用魚卵和延長顯微注射時間，每次只從冰箱中取少量精、卵混合受精，剩余的精、卵存在4℃冰箱中保存。將鱖的總DNA用顯微注射器注射到鯽受精卵的核區附近，注射量在1nL左右。共導入鯽受精卵2 000余尾，獲得試驗魚400尾，放入466.7m2池塘飼養（魚苗從平游到長成當年魚種，依次投喂豐年蟲、大型浮游動物、破碎料和顆粒飼料）。用這種方法保存的精、卵，可使用6～8小時，保證一天都能有充足的精、卵進行導入外源基因研究工作。

1.2.2 AFLP雙酶切

酶切組合為Mse I/EcoR I，建立20μL反應體系（10×NE Buffer4 2μL，BSA 0.2μL），37℃水浴酶切2h后，立即65℃滅活20 min。

1.2.3 AFLP接頭的制備和連接

用單鏈寡核苷酸制備雙鏈接頭，使Mse I接頭序列終濃度為50μM，EcoR I接頭序列終濃度為5μM。94℃變性，緩慢冷卻至10℃，退出PCR程序，完成雙鏈接頭的制備。

1.2.4 AFLP預擴增反應

建立20μL預擴增體系。反應程序為：94℃30s，56℃1min，72℃1min，20個循環，最后72℃延伸7min。

1.2.5 AFLP選擇擴增反應

將預擴增產物用無菌去離子水或1/10 TE稀釋10倍作為選擇擴增的模板。建立25μL選擇擴增反應體系。反應程序：94℃30s，65℃30s，72℃60s，13 個循環；每個循環復性溫度降低0.7℃，94℃30s，56℃30s，72℃60s，23 個循環。

1.2.6 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

用6%的變性聚丙烯酰胺凝電泳檢測選擇性擴增產物。制膠，點樣，變性后的PCR選擇擴增產物點5μL即可。待溴酚藍指示劑電泳出凝膠時結束電泳。采用Sanguinetti銀染法[13]進行銀染，照相，分析。

1.2.7 目的條帶回收測序

將差異性條帶挖出轉移至0.5mL離心管中，加20μL 無菌水，65℃水浴 40min，12 000 r/min 離心10min，取以上清液作模板，用原來選擇擴增引物進行PCR再擴增，PCR程序與AFLP選擇擴增程序相同，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用瓊脂糖電泳DNA回收試劑盒回收目的條帶回收，測序。

2 結果與分析

2.1 顯微介導鱖基因鯽基因組DNA提取結果

DNA定量分析儀測定表明，提取的顯微介導鱖基因鯽基因組DNA OD260/OD280均在1.8～2.0之間，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖1）也顯示DNA條帶清晰，可用于AFLP后續實驗。

2.2 AFLP擴增結果

圖1 顯微介導鱖基因鯽基因組DNA瓊脂糖電泳結果Fig.1 Agarose electrophoresis of the micro-injected exogenous Siniperca chuatsi gene crucian carp genomic DNA

以鱖基因組DNA為陽性對照，以普通鯽基因組DNA為陰性對照。對118尾顯微介導鱖基因鯽的AFLP檢測表明，在15對AFLP引物中，有2對AFLP引物在48尾顯微介導鱖基因鯽中擴增出了和外源鱖基因相同而對照鯽沒有的帶，陽性率為40.67%。圖2是其中的5對引物對部分顯微介導鱖基因鯽的AFLP擴增電泳圖，箭頭所標示的就是供體基因片段。其中引物E-ACA/M-CAC在1個位點上擴增出5個供體基因片段，而引物E-AAC/M-CAG在2個位點上擴增出10個供體基因片段。

圖2 顯微介導鱖基因鯽E-ACA,M-CAC引物擴增電泳Fig.2 Agarose electrophoresis of E-ACA and M-CAC primers amplification in the micro-injected exogenous Siniperca chuatsi gene crucian carp

圖3 顯微介導鱖基因鯽序列與鱖供體基因序列比對結果Fig.3 Sequence alignment of micro-injected exogenous Siniperca chuatsi gene crucian carp and donor Siniperca chuatsi

2.3 顯微介導鱖基因鯽目的條帶測序結果

為進一步找到精確的遺傳證據，在AFLP試驗結果中，對其中5尾陽性顯微介導鱖基因鯽擴增出來的與外源供體鱖基因相同的帶，而鯽中沒有的條帶進行回收。回收產物濃度均為30ng/μL，經瓊脂糖電泳和紫外分光光度計檢測，符合測序規格的樣品測序（圖3）。結果顯示，陽性顯微介導鱖基因鯽均含有供體基因目的片段。

3 討論

DNA分子標記是直接反映種群或個體間基因組DNA間的差異，獲得差異特征的DNA片段。擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism,AFLP）標記[14]可以快速、簡單、穩定地得到來源于不同材料的DN A指紋圖譜[15]，可以掃描一個物種的全基因組，而不需要了解被研究物種的DNA序列。這是因為AFLP標記所顯示的限制性內切酶酶切片段的長度多態性，是由選擇性擴增基因組DNA酶切片段產生。在檢測基因組DNA時，這種多態性是以擴增片段的長度不同而檢測出來，每次反應產物的譜帶在50～100條之間，一次分析可以同時檢測多個位點，多態性極高，信息量大，產生的標記數目多，分辨率高，結果可靠，是快速檢測魚類基因組DNA的好方法。近年來，AFLP技術也逐漸用于檢測轉外源基因組DNA。姬生東等[16]利用AFLP分子標記技術檢測導入外源玉米DNA的苜蓿Medicago sativa Linn，在苜蓿中篩選到差異條帶數，證明由離子束介導外源DNA導入可以引起受體苜蓿基因組DNA發生變異。閆學春等[5-7]利用AFLP分子標記技術，在受體鯉（鏡鯉）中均檢測到來自供體中國對蝦（河蟹）基因組DNA，證明受體鯉（鏡鯉）中含有供體基因片段。本研究中，在顯微介導鱖基因鯽的AFLP指紋圖譜中擴增出鱖基因片段，從分子水平上驗證鱖基因已經成功導入受體鯽中，隨后對這些目的DNA片段回收、克隆、測序，顯微介導鱖基因鯽的序列與鱖的序列進行比較，發現堿基序列有高度的同源性，更進一步驗證鱖供體基因組已經成功導入受體鯽中。檢測目的DNA序列是否源于鱖DNA，為顯微介導外源總DNA導入技術提供更確鑿的分子證據。

本研究采用顯微介導遠緣雜交技術，嘗試鱖基因組DNA與鯽基因組DNA的超遠緣基因雜交，利用AFLP技術測出了顯微介導處理的鯽含有供體基因DNA片段。分析顯微介導鱖基因鯽的多態性，以期為顯微介導外源總DNA片段的導入，創制鯽新種質技術提供理論數據。在AFLP實驗中，對提取實驗魚DNA的質量要求很高，實驗的成功率在很大程度上取決于模板DNA的純度，即AFLP成功的關鍵要有高純度的模板DNA[17]。在AFLP雙酶切實驗步驟中，可以使酶切中的限制性內切酶的活性發揮到最大化。高純度的模板DNA是關鍵，它可使酶切更加充分，酶切結果才更加符合后續實驗的要求[18]。所以，在模板DNA的提取過程中必須嚴格按照實驗步驟進行，提取出符合實驗要求的無蛋白質和RNA雜質污染的高純度模板DNA，以保證后續實驗的順利開展。

顯微介導鱖基因鯽是在鯽中導入了鱖的基因組DNA，兩個物種的雜交存在于基因組水平，而非傳統意義上的精卵細胞雜交。檢測表明，在受體魚中明顯出現供體的DNA片段，根據周光宇等[19]提出的DNA片段雜交假說，這種帶有部分親和的遠緣物種的結構基因、調控基因的雜交DNA片斷，即部分與母本同源的DNA片斷有可能重組進入母本，使雜種性狀出現變異，說明這種基因組雜交的方法是可行的。目前，水產生物轉基因所需的優異基因資源非常有限，這也是限制利用功能基因改善水產生物品質的主要問題。孫曉波等[20]將辣椒Capsicum annuum L.花粉中高賴氨酸蛋白基因Cflr導入小麥Triticum aestivum L.中，檢測結果顯示陽性；朱吉等[21]的研究結果表明，湖南豬Sus原發性心肌癥相關蛋白5基因（CMYA5）的多態性與豬肌肉品質性狀相關；施培松等[22]開展了匙吻鱘Polyodon spathula脂肪酸合成酶（FAS）基因的克隆及FAS基因mRNA在魚不同組織肌肉中的表達研究，發現在肝臟等10種組織中均檢測到FAS基因mRNA的表達，而在肝臟中的表達量最高；孫志鵬等[23]開展了鯉Cyprinus carpio L.脂肪酸合成酶基因的克隆與表達分析，發現FASN基因在鯉腦組織中表達量最高。隨著對水產生物品質育種的逐漸重視，以及水產生物基因組測序和生物信息學在水產生物基因組結構和功能研究的廣泛應用，從與鯽品質相關的功能基因方面研究顯微介導鱖基因鯽與普通鯽的不同，將有助于深入了解其肌肉品質的差異和更加深入的認識脂肪酸、氨基酸等一系列代謝過程[7]。至于影響鯽肌肉的品質的基因，即鱖基因在受體鯽的精細調控機制還有待進一步研究。