超聲輔助脫脂對牦牛骨粉制備及其理化特性的影響

秦曉潔，沈青山，賈 偉，張春暉,，鄭乾坤

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超聲輔助脫脂對牦牛骨粉制備及其理化特性的影響

秦曉潔1，沈青山1，賈 偉1，張春暉1,2※，鄭乾坤2

（1. 中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；2. 得利斯集團有限公司，濰坊 262216）

為提高牦牛骨粉的脫脂率，以青海牦牛股骨為原料進行超聲輔助有機溶劑脫脂參數優化，并比較分析了超聲脫脂法和蒸煮脫脂法對骨粉制備的影響。該文以脫脂率為指標篩選高效脫脂溶劑；通過響應面法對超聲脫脂參數（超聲功率、脫脂時間及液料比）進行優化；對比分析了2種脫脂牦牛骨的脫脂率、蛋白質流失率、主要礦物質流失率、微觀形態及其骨粉的粒徑分布、微觀形態、化學結構和鈣離子釋放度。結果顯示：乙酸乙酯為最佳脫脂溶劑；超聲功率500 W，超聲時間30 min，液料比（體積質量比）6為最佳脫脂參數，此條件下脫脂率達92.00%，顯著高于蒸煮脫脂法（71.25%）（<0.01）；與蒸煮脫脂法相比，超聲脫脂法蛋白質流失率（8.11%），主要礦物質元素Na、K、Fe、Mn流失率顯著降低（<0.05），微觀結構更加致密；超聲脫脂法和蒸煮脫脂法制得牦牛骨粉中值粒徑（D50）分別為35.84和11.73；紅外光譜顯示兩者化學結構無明顯變化；鈣離子釋放度結果顯示兩者同樣無顯著差異（>0.05）。超聲波輔助有機溶劑脫脂處理制備骨粉可更多保留骨中營養物質，對改善骨粉加工工藝及提高骨粉品質具有一定的參考價值。

超聲；脫脂；溶劑；牦牛；骨粉；蒸煮

0 引 言

牦牛是生活在中國青藏高原的特色物種之一，牦牛骨骼（yak bone，YB）占軀體總生物量1/3，富含膠原蛋白、軟骨素、維生素以及鈣、磷、鎂、鋅等骨生長必需的營養素[1-2]，其中膠原蛋白占總蛋白質量的35%～40%[3]。研究表明，動物骨中的蛋白質具有很高的營養價值[4]，其中的骨膠原蛋白肽能改善人體皮膚膚質[5]，促進大鼠股骨的骨折愈合和人成骨細胞I型膠原蛋白基因的表達[6]。此外，骨骼中的Ca∶P比值近似為2，是人體吸收鈣磷的最佳比例[7]，但多以磷酸鈣形式存在于羥基磷灰石晶體中，溶解度很低并且羥基磷灰石與膠原蛋白有機結合，難以得到有效利用[8-9]。

對原料骨進行脫脂處理是骨粉制備的前提。目前，以牦牛骨為原料開發了骨粉、明膠等一些基礎生化原料和牦牛骨髓壯骨粉等保健品[10-11]。趙要武等[12]研究發現牦牛骨粉（yak bone powder，YBP）可增加骨密度，并具有較高的鈣表觀吸收率。但牦牛骨中含有大量油脂，其產品極易氧化酸敗，產生不良風味和有害物質[13]，影響產品感官品質，危害身體健康[14-15]。同時，脂肪的存在不利于畜骨進一步粉碎，阻礙蛋白質溶出和礦物質元素吸收，對骨粉品質有很大影響[16-17]。脫脂處理可以明顯改善肉骨粉的風味和色澤，顯著提高肉骨粉的品質[18]。傳統的動物脫脂法有機溶劑法、酶法、酸堿法、蒸煮法和超聲波乳化法等[19]，普通有機溶劑法脫脂率較高，但存在耗時長、溶劑殘留等問題；酶法不易分離，后續加工困難且成本高；酸堿法脫脂率較高，但容易對原料中的蛋白等營養物質造成損傷，污染環境不利于實際生產；蒸煮法在生產實踐中以高溫高壓蒸煮為主，但脫脂率低，生產成本較高，易造成營養物質損失。

超聲輔助脫脂技術是利用超聲波產生的空化作用及伴隨產生的熱效應、機械效應等次級效應，能夠有效加速油脂的擴散和溶出[20-21]。超聲波輔助乳化劑可使豬皮的脫脂率達到68.67%[22]；超聲輔助常溫脫脂可使蠶蛹的脫脂率達到96.8%[23]。然而使用超聲波輔助有機溶劑對骨原料脫脂制備骨粉的研究尚未見報道。本研究對超聲波輔助有機溶劑脫脂方法進行優化，旨在提高脫脂率的同時保留更多營養成分以提高產品質量和穩定性，為改善牦牛骨和其他畜禽骨骨粉加工工藝提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料骨：隨機選取來自青藏地區的2～3歲牦牛6頭，屠宰后取其股骨（不含軟骨）剔除碎肉、筋等雜質，粉碎得到5～10 mm的骨顆粒于–20 ℃保存備用。

試劑：無水乙醇，異丙醇，正己烷，乙酸乙酯，氫氧化鈉，濃硫酸，高氯酸，異丙醇，硝酸，無水乙酸鈉，一水檸檬酸，正丙醇，氯胺，對二甲氨基苯甲醛，氧化鑭，碳酸鈣，鹽酸，胃蛋白酶（1 200 U/g）。以上試劑皆為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FW 100高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；歐諾全溫度恒溫培養搖床（天津市歐諾儀器儀表有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（天津市中環實驗電爐有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）； SER148脂肪測定儀（意大利VELP公司）；KJELTEC2300型全自動凱氏定氮儀（丹麥FOSS公司）；行星式球磨儀PM200（上海弗尓德儀器設備有限公司）；CAMSIZER X2（上海弗尓德儀器設備有限公司）；紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；雙光束原子吸收分光光度計（日本島津公司）；傅里葉近紅外光譜分析儀（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR，瑞士Bruker公司）；場發射環境掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.3 方法

1.3.1 牦牛骨基本成分測定

脂肪含量測定：索氏抽提法，依照GB5009.6-2016進行。水分含量：直接干燥法，依照GB5009.3-2016進行。灰分含量：馬弗爐高溫灼燒法，依照GB5009.4-2016進行。蛋白質含量：凱氏定氮法，依照GB5009.5-2016進行。羥脯氨酸含量：依照GBT9695.23-2008進行測定。Ca含量測定：火焰原子吸收光譜法，依照GB5009.92- 2016進行。礦物質含量測定：電感耦合等離子體質譜法，依照GB5009.268-2016進行。

1.3.2 牦牛骨脫脂參數優化試驗

1）脫脂工藝

蒸煮脫脂法[24]：牦牛腿骨（30 g）→剔除筋膜、肉等雜質→初步粉碎（5～10 mm）→稱樣并預煮2 min去腥→瀝干→高溫高壓蒸煮處理（118℃，90 min，骨：水比為1：2.5）→撇除上層油脂并瀝干→75 ℃條件下通風干燥12 h。

超聲脫脂法：牦牛腿骨（30 g）→剔除筋膜、肉等雜質→初步粉碎（5～10 mm）→稱樣→與脫脂溶劑以一定的液料比混合→超聲脫脂處理→溶劑回收→38℃條件下通風干燥12 h→測定殘留脂肪含量。

2）脫脂溶劑的篩選

基于不同脫脂溶劑在其他脫脂研究中的應用條件，本試驗中分別選取無水乙醇、異丙醇、正己烷、乙酸乙酯作為脫脂溶劑，在超聲功率300 W、液料比（體積質量比，下同）為2、時間為20 min的條件下（常溫）對牦牛骨進行超聲脫脂，測定脫脂前后牦牛骨中的脂肪含量，比較4種不同溶劑的脫脂效果，計算脫脂率。

3）單因素試驗設計

在30 ℃的恒定水溫條件下對牦牛腿骨進行超聲脫脂單因素實驗，各因素的基本條件為：超聲功率300 W、脫脂時間20 min、液料比為2。各因素梯度分別設置為：超聲功率：200、300、400、500、600 W；脫脂時間：20、30、40、50、60 min；液料比：2、3、4、5、6。每次改變其中一個因素，進行單因素試驗。以牦牛骨的脫脂率為評價指標，每個因素重復試驗3次，測定結果取平 均值。

4）響應面試驗設計

在單因素試驗結果基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，考察超聲功率、脫脂時間、液料比3個因素及其交互作用對脫脂率的影響，試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面設計因素及水平表

1.3.3 脫脂率、膠原蛋白含量及流失率計算

脫脂率的計算：取5 g脫脂牦牛骨，依照GB 5009.6- 2016對其脂肪含量進行測定，做3次平行，取平均值，脫脂率的計算按照公式（1）。

式中為脫脂率，%；1為原料牦牛骨中脂肪的質量，g；0為脫脂牦牛骨中脂肪的質量，g。

膠原蛋白含量的計算：取100 mg脫脂牦牛骨，依照GB/T9695.23-2008對其羥脯氨酸含量進行測定，做3次平行，取平均值，膠原蛋白含量及流失率的計算分別按照公式（2）、（3）。

式中羥脯氨酸為羥脯氨酸質量，mg；為膠原蛋白質量，mg；為膠原蛋白流失率，%；0膠原蛋白為原料牦牛骨中膠原蛋白質量，mg；1膠原蛋白為脫脂牦牛骨中的膠原蛋白質量，mg，6.77為羥脯氨酸與膠原蛋白之間的換算系數[25]。

1.3.4 牦牛骨粉制備

備用脫脂牦牛骨用高速萬能粉碎機粉碎45 s（15 s/次，共3次），篩分獲得60～100目牦牛粗骨粉，用行星式球磨儀制備牦牛骨粉備用[26]。參數設置：350 r/min，4 h，磨球直徑為10 mm。

1）牦牛骨及骨粉主要礦物質流失率計算

牦牛骨及骨粉主要礦物質含量依照GB 5009.268-2016進行測定，做3次平行，取平均值，流失率率的計算按照公式（4）。

式中0礦物質元素為原料牦牛骨中礦物質元素質量，mg，1礦物質元素為脫脂牦牛骨中礦物質質量，mg，為礦物質元素流失率，%。

2）牦牛骨粉粒度分布及其微觀形態觀察

粒度分布：牦牛骨粉的粒度分布采用CAMSIZER X2測定，骨粉的平均粒徑采用中值粒徑50表示。

微觀形態：牦牛骨及骨粉的微觀形態參考Yin等[27]，采用掃描電鏡觀察，加速電壓為10 kV。

3）牦牛骨粉化學結構分析及鈣離子釋放度測定

化學結構分析：化學鍵分析參考Boutinguiza等[28]的方法，用FT-IR紅外光譜分析儀分析，波數掃描范圍為600～4 000 cm–1。

鈣離子釋放度檢測：稱取0.25 g牦牛骨粉于50 mL離心管（精確至0.001 g），加入25 mL消化液（用HCl調至pH值為2），添加胃蛋白酶（60 U/mL），混勻，封口。將上述離心管放置37 ℃恒溫搖床提取3 h，100 r/min。提取結束后，在4 000 r/min條件下離心30 min。取上清過濾并定容至100 mL容量瓶，稀釋100倍后用火焰原子吸收光譜儀進行檢測[29]。做3次平行試驗。其計算公式如（4）。

式中為牦牛骨粉鈣離子釋放度，%；上清鈣為上清液中鈣的質量，mg；樣品鈣為樣品中鈣的總質量，mg。

1.3.5 數據處理方法

運用SPSS22.0軟件one-way ANOVA 對數據進行方差分析同時利用 Duncan 新復極差法進行顯著性檢測，其中各圖同一指標中不同字母表示差異顯著（<0.05或<0.01）運用Origin8.0作圖；利用Design-Expert 8.0軟件對響應面的數據進行方差和線性回歸分析。

2 結果與分析

2.1 牦牛骨基本成分含量表

牦牛骨基本成分含量如表2所示。脂肪含量高達25.15%，不利于骨的進一步粉碎，其產品極易氧化酸敗，嚴重影響骨粉品質[16-17]。蛋白含量為24.90%，高于魯西牛、延邊牛、南陽牛、秦川牛的同部位蛋白含量[30]。這表明，牦牛骨雖然富含營養成分但脂肪含量較高，因此有必要對牦牛骨進行脫脂處理。

表2 牦牛骨主要成分含量

2.2 超聲波輔助有機溶劑脫脂參數優化結果分析

2.2.1 單因素試驗結果

由圖1a可以看出，正己烷和乙酸乙酯脫脂效果顯著優于無水乙醇和異丙醇，二者之間無顯著差異（>0.05）。此外，乙酸乙酯具有良好的溶解性、揮發性，其沸點低、毒性小，是一種易于回收并被國家標準規定允許使用的食品添加劑。因此最終選取乙酸乙酯作為最適脫脂溶劑。

由圖1b可以看出，牦牛骨脫脂率隨超聲功率的增大呈遞增趨勢，可能由于功率增大，空化效應和機械振動增強，其具有的能量和波動性促進了分子的擴散速度[19]，從而促進骨中油脂的溶出。當超聲功率為400 W時，其脫脂率為76.8%。但當超聲功率超過400 W時，脫脂率變化減緩，這可能是由于脫脂溶劑的溶脂能力已趨于飽和，400與500、600 W的超聲功率對脫脂率無顯著差異（>0.05）。因此，選取400 W為最佳條件進行后續試驗。

注：圖1a超聲功率300 W，超聲時間20 min，液料比2；圖1b超聲時間20 min，液料比2；圖1c超聲功率500W，液料比2；圖1d超聲功率500 W，超聲時間30 min；不同字母表示差異顯著（P<0.05），下同。

由圖1c可以看出，脫脂率隨超聲時間的延長而不斷提高。在超聲時間為10～30 min時，脫脂率隨超聲時間迅速上升，而在30～60 min內，脫脂率增加趨勢變緩。超聲波的作用由表及里，隨著其不斷深入牦牛骨內部，油脂的擴散率相應減少[31]。因此，當超聲脫脂達到一定時間后，脫脂率增加趨勢會減緩。當超聲波的作用完全抵達牦牛骨內部時，繼續延長時間則不會再產生影響。當脫脂時間為30 min時，脫脂率可達78.2%，且與40、50、60 min時的脫脂效果無顯著差異（>0.05），因此選取30 min為后續試驗的脫脂時間。

由圖1d可以看出，液料比為2～5時，脫脂率隨著液料比的增大呈上升趨勢。這是由于對于一定質量的牦牛骨來說，溶劑用量的增加會降低溶劑中油脂的濃度，增加牦牛骨與溶劑接觸表面的濃度差，從而促使傳質推動力的增加[32-35]。當脫脂溶劑用量增大到一定程度后，牦牛骨中的大部分油脂已經溶出，隨用量持續增加，油脂溶出漸緩，從經濟角度考慮，可選擇液料比為5作為后續優化試驗的最適條件。當液料比為5時，其脫脂率與液料比為6、7的脫脂率已無顯著差異（>0.05），脫脂率可達84.5%。

2.2.2 Box-Behnken試驗設計與結果

響應面試驗共17個試驗點，其中12個為析因點，5個零點試驗以估計誤差。響應面試驗結果如表3所示，1表示脫脂率。

通過Design-Expert 8.0軟件對數據進行多元回歸擬合分析，脫脂率（1）與超聲功率（）、超聲時間（）和液料比（）之間建立二次回歸模型如公式（6）。

1=80.36+3.83+1.29+2.70+0.52+

1.15+1.19+2.032+0.892+0.812（6）

表3 響應面設計試驗結果

2.2.3 回歸方程顯著性分析

為了考察模型的擬合度，尋找主效應顯著性以及各因素之間的相互作用，對回歸方程進行ANOVA方差分析，其結果如表4所示。

從表4中可以看出，該模型的<0.01，值為14.29，說明所選模型極顯著；失擬項的>0.05，說明其他因素對實驗結果的影響較小，該模型在整個回歸區域內擬合較好；2Adj–2Pre<0.2，說明該模型可充分說明工藝過程[36]。方差分析結果表明，該模型與試驗具有較高的擬合度，能很好的反映出各因素與脫脂率之間的關系。通過值的檢驗結果發現，該模型一次項、的值小于0.01，對模型貢獻大，因此其對脫脂率影響極顯著，而一次項、二次項2的值小于0.05，表明其對脫脂率影響顯著。此外，交互項、的值小于0.15，是影響脫脂率的重要因子。由檢驗可以得出超聲功率、超聲時間和液料比對牦牛骨脫脂率都有一定的影響，其因子貢獻率為超聲功率>料液比>超聲時間，但其交互作用不顯著。

表4 方差分析表

注：***表示極顯著（0.01），* *表示顯著（<0.05），*表示重要因子（<0.15）。

Note: ***represents highly significant (<0.01), **represents significant (< 0.05), *represents important factor (<0.15).

2.2.4 響應曲面與等高線分析

依據回歸擬合函數以及各因素對牦牛骨脫脂率的影響，每2個因素對牦牛骨脫脂率畫出響應面和等高線圖，考慮到定性分析各因素對牦牛骨脫脂率的關系，固定另外1個因素時，均作“0”水平處理。圖2為各因素交互作用的響應面和等高線圖。

圖2 AB、AC、BC交互作用對牦牛骨脫脂率的影響

對牦牛骨脫脂率影響顯著的因素，表現為等高線密集、曲線較陡，響應值變化較大；反之，等高線疏松、響應曲面較為平滑，響應值變化較小[37]。因此由圖可以判斷各因素對響應值的影響程度為：>>；2因素之間的交互作用較弱，影響程度為：>>；與方差分析結果一致。

鑒于不能直接從響應曲面上找出最佳的工藝參數，需要進一步分析。利用Design-expert軟件對所得到的回歸方程進一步分析，考慮到能耗，在脫脂率大于91%的情況下選擇能耗最低的最佳工藝參數：超聲功率499.86 W、超聲時間30.7 min、液料比5.99，模型預測在此條件下的理論脫脂率為91.02%。為驗證響應面所得結果的可靠性，考慮到實際操作的便利、成本等因素，修正工藝參數為：超聲功率500 W、超聲時間30 min、液料比為6，進行驗證試驗。使用上述超聲脫脂條件進行3次重復驗證試驗，得到實際牦牛骨脫脂率為92.00%±0.20%，驗證值與預測值的相對誤差為1.08%，誤差較小，表明驗證值與模型所得到的預測值基本接近，優化結果具有可靠性。

2.3 不同脫脂方式結果分析

2.3.1 脂肪、蛋白質和膠原蛋白含量比較分析

將牦牛骨分別采用超聲波法和蒸煮法進行脫脂處理，獲得結果如圖3所示。根據公式（1），超聲波法和蒸煮法所獲得的牦牛骨脫脂率分別為92.00%、71.25%；經脫脂處理后，牦牛骨中總蛋白具有不同程度的流失，由公式（2）、（3）計算得超聲波法和蒸煮法蛋白流失率分別為8.11%、13.28%，其中膠原蛋白流失率分別為11.05%、18.40%。2種不同處理方法都會對牦牛骨中蛋白質造成一定程度的流失，牦牛骨經超聲波處理后，其中部分與酯類結合的蛋白質隨著油脂的溶出而流失；除與酯類結合的蛋白質，牦牛骨中還存在少量水溶性蛋白質，并且高溫高壓條件下蛋白質三螺旋結構解體，骨組織被破壞，導致牦牛骨蛋白質流失率增大[38]。

圖3 不同脫脂方法對牦牛骨中脂肪含量、總蛋白含量以及膠原蛋白含量的影響

2.3.2 礦物質含量比較

利用電感耦合等離子體質譜法對經2種方法處理的脫脂牦牛骨中P、Ca等12種礦物質含量測定，結果如表5所示。經高壓蒸煮處理的牦牛骨中Na、K、Fe、Mn等元素流失嚴重，根據公式（4）計算得流失率分別可達19.00%、58.95%、14.32%、20.86%，這可能由于牦牛骨經過高壓高溫處理后，部分蛋白質結構解體，骨組織變得疏松多孔，礦物質得以釋放并以離子形式游離到水中[37]而流失；經超聲波處理的牦牛骨，Fe、Zn、Mn等元素亦存在流失現象，流失率分別為18.66%、2.18%、15.04%，這可能與乙酸乙酯具有一定溶解金屬元素的能力有關。但2種脫脂牦牛骨中P、Ca、Mg、Cu、Se、Mo、Sr等元素與原料骨中的含量無明顯差異，這可能由于該類元素存在于羥基磷灰石中并與蛋白質緊密結合，很難以離子的形式游離出來。由此，與高壓蒸煮相比，超聲脫脂法能顯著降低礦物質流失率（<0.05），能夠更大程度地保留骨粉中的礦質元素。

表5 礦物質含量

注：結果以平均值±標準差表示，a～c為不同樣品間存在顯著差異（<0.05）。

Note: Results are indicated by mean ± standard deviation, and a-c indicate significant differences between different samples at 0.05 level.

2.3.3 牦牛骨微觀形態觀察

選取經不同方法處理的牦牛骨，并對其股骨頭和股骨體2部分結構進行比較分析，掃描電鏡結果如圖4所示。經2種方法處理后，牦牛骨在油脂減少的同時，其結構由致密、規則變得疏松、多孔。經超聲脫脂處理后，一方面分布在骨結構中的油脂被溶出，使縫隙、孔洞等原有結構更明顯突出，另一方面由于超聲波所具有的空化效應和機械振動作用，使骨結構產生一定的疏松，孔隙增加。經蒸煮脫脂處理后，股骨體孔洞明顯增加，股骨頭產生一定程度的破碎，這可能是由于高溫打斷了膠原蛋白分子內氫鍵使其三螺旋結構解體[39]，并進一步破壞了與礦物質的結合[40]，這也可能是造成礦質元素流失嚴重的原因之一。

2.4 不同脫脂方式制備骨粉結果分析

2.4.1 骨粉粒徑分布及微觀形態比較分析

利用粒度分析儀對經2種方法處理制備的牦牛骨粉進行粒徑分布比較分析，結果如圖5所示。經球磨后，超聲脫脂牦牛骨粉中值粒徑為(35.84±0.60)m，90%顆粒分布在75m以內；蒸煮脫脂牦牛骨粉中值粒徑為(11.73±0.29)m，90%顆粒分布在40m以內。蒸煮脫脂牦牛骨粉粒徑要顯著小于超聲脫脂牦牛骨粉，分布寬度窄，這是因為牦牛骨經高壓高溫處理后，其結構遭到破壞，變得更為疏松多孔，從而更利于超微粉碎的進行[24]。

圖4 不同脫脂方法對牦牛骨微觀結構的影響

圖5 牦牛骨粉粒度分布及微觀形態比較分析

對經2種方法處理的牦牛骨粉進行掃描電鏡分析，結果如圖5b、5c所示。蒸煮脫脂牦牛骨粉粒徑較小，分布更均勻，大多呈現橢圓形，形狀更加規則；超聲脫脂牦牛骨粉粒徑分布范圍較廣，存在形狀不規則的大顆粒。與牦牛骨掃描電鏡圖和粒徑分布圖結果一致。

2.4.2 骨粉化學結構及鈣離子釋放度分析

傅里葉紅外圖譜是區分物質差異的一種有效手段。紅外光譜分為600～1 300 cm–1的指紋區和1 300～4 000 cm–1的官能區。官能區為高頻區，通常被用來檢測物質中官能團的種類以及變化[41]；指紋區可反映出單鍵的伸縮振動和變形振動，吸收峰因分子結構不同而產生差異[42]。

對經2種不同方法處理的牦牛骨粉進行傅里葉紅外掃描分析，結果如圖6所示。872 cm–1是CO32–的彎曲振動吸收峰，為CO32–進入羥基磷灰石晶格取代PO43–的特征吸收峰[27,43-44]，1 450、1 512 cm–1是CO32–的拉伸振動吸收峰[45]，1 026 cm–1為PO3–1的對稱伸縮振動[46]；1 238 cm–1屬酰胺Ⅲ帶，是C–N伸縮振動和N–H彎曲振動，以及甘氨酸主鏈脯氨酸側鏈上–CH2的非平面搖擺振動的特征吸收峰；1 600～1 700 cm–1多肽主鏈上C=O伸縮振動，1 647 cm–1屬酰胺I帶吸收峰；1 743 cm–1為酯類C=O伸縮振動峰，為骨油吸收峰[43]；2 854和2 927 cm–1的吸收峰是C–H有機物拉伸振動吸收峰[43, 47]。

由圖6a可得，2種脫脂牦牛骨粉化學結構大體相同，皆以磷酸鹽和碳酸鹽為主，含有少量的有機物；超聲脫脂牦牛骨粉在1 743、2 853、2 922㎝–1處無明顯峰值，這可能是由于其油脂去除完全，而蒸煮脫脂牦牛骨粉中殘留脂肪高，出現明顯峰值。

通過對牦牛骨粉鈣離子釋放度進行測定，根據公式（5），結果顯示二者鈣離子釋放度無顯著差異（>0.05）（如圖6b所示）。研究表明75m牦牛骨粉鈣離子釋放度大于100m骨粉鈣釋放度[38]，但小于75m牦牛骨粉不同粒徑之間鈣離子釋放度是否存在差異尚未見報道。本研究中，牦牛骨經超聲脫脂和蒸煮脫脂后制備2種脫脂骨粉的中值粒徑分別為35.84和11.73m，兩者分布寬度窄、差距相對較小，因而可能導致其鈣離子釋放度差異不顯著（>0.05）。這一結果同樣表明利用高效超聲脫脂工藝處理制備的牦牛骨粉粒徑雖然大于蒸煮脫脂牦牛骨粉粒徑，但并不會顯著影響鈣離子釋放度（> 0.05），說明該種脫脂工藝具有可行性。另外，蒸煮脫脂牦牛骨粉的脂肪含量顯著高于超聲脫脂牦牛骨粉（如圖3所示），較高殘留脂肪可能會影響鈣離子的釋放，從而導致2種骨粉的鈣離子釋放度沒有顯著差異（>0.05）。

圖6 牦牛骨粉化學結構及鈣離子釋放度

3 結 論

本文通過響應面法對牦牛骨超聲脫脂參數進行了優化，并比較分析了超聲脫脂法和蒸煮脫脂法對制備骨粉的影響，得出以下結論：

1）超聲脫脂參數優化各因素對脫脂率的影響順序為：超聲功率>液料比>超聲時間，其中超聲功率和液料比對脫脂率有極顯著影響，但兩兩因素間無明顯交互作用；超聲脫脂的最佳參數：超聲功率500 W、超聲時間30 min、液料比為6，在此條件下脫脂率為92.00%± 0.20%。

2）超聲脫脂率顯著高于蒸煮脫脂率（<0.01），超聲脫脂可以更大程度地保留蛋白質、礦物質等營養成分（< 0.01）。

3）超聲脫脂后制得骨粉中值粒徑（35.84±0.60）m高于蒸煮脫脂后制得骨粉中值粒徑（11.73±0.29）m；2種骨粉化學結構和鈣離子釋放度不存在顯著差異。

該研究提供了一種高效脫脂的方法，為改善牦牛骨和其他畜禽骨骨粉加工工藝及提高骨粉品質提供參考。

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Effect of ultrasonic-assisted degreasing on preparation and physicochemical properties of yak bone powder

Qin Xiaojie1, Shen Qingshan1, Jia Wei1, Zhang Chunhui1,2※, Zheng Qiankun2

(1.100193,2.262216)

In order to reduce the degreasing rate and improve the quality of yak bone powder, the ultrasonic assisted organic solvent degreasing method was studied based on the thighbone of Qinghai yak in this paper, and the nutrient contents and physicochemical properties were analyzed comparing with the traditional boiling degreasing method. Firstly, the degreasing solvent was screened according to degreasing rate and applicability among four common organic solvents. Basing on the single factor test, Box-Behnken test was designed to optimize the parameters including ultrasonic power, degreasing time and the ratio of liquid to material. After that, the analysis of the degreasing rate, the loss rate of protein, collagen, main minerals and the microstructure of yak bone treated by ultrasonic and boiling was carried out. Subsequently, the particle size distribution, microstructure, chemical structure and calcium release rate of yak bone powder dealt with the planetary ball mill were shown as well. Results suggested that ethyl acetate was the optimal degreasing solvent with a higher degreasing rate and better applicability under the same conditions. In addition, the two regression model built by response surface design had a good fitting degree with the correlation coefficient of 0.9484 indicating that the model fitted well in the whole regression region.Considering the energy consumption, the optimum degreasing conditions were finally determined as follows: ultrasonic power is 500 W, ultrasonic time is 30min, and the ratio of liquid to material (mL/g) is 6, under which conditions the degreasing rate could reach 92.00%±0.20% and the relative error of the predicted value was 1.08% which was less than 5% revealing that the model was effective. Besides that, it was also found that the degreasing rate of ultrasonic (92.00%±0.20%) was significantly higher than that of boiling method (71.25%±2.31%) (<0.05). Meanwhile, the loss rate of protein and collagen were 8.11%±0.48%, 11.05%±2.45%, respectively, which were dramatically lower (<0.05). And there was a serious loss of Na, K, Fe, Mn in cooked yak bone that were 19.00%±1.44%, 58.95%±1.04%, 14.32%±2.46% and 20.86%±1.29% respectively while the loss about Fe, Zn, Mn in ultrasonic skimmed yak bone was slightly, and the contents of P, Ca, Mg, Cu, Se, Mo, Sr in the bone treated with the two methods were similar (>0.05). As for the microstructure of yak bone, the boiling one was looser and more porous. After pulverization, the median diameter of ultrasonic defatted bone powder was (35.84±0.60)m while the other was (11.73± 0.29)m, which was in agreement with the result of scanning electron microscope. Moreover, no significant difference had been observed in the chemical structure, and there were mainly phosphate and carbonate in two kinds of bone powder. For the calcium release rate of bone powder, result indicated that both methods had no significant difference (>0.05). In conclusion, the ultrasonic assisted organic solvent degreasing method could remain more nutrients with the higher degreasing rate. This study provided a high efficient degreasing method, which has the value for improving the processing technology for preparing the yak bone powder.

ultrasonic; degreasing; solvent; yak; bone powder; boiling

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.21.034

TS251.9

A

1002-6819(2018)-21-0272-09

2018-06-01

2018-09-19

西藏自治區重點科研項目“特色農產品加工技術與產品開發”；國家“萬人計劃”科技創新領軍人才項目；鳶都產業領軍人才資金資助。

秦曉潔，研究方向：畜產品加工利用。 Email：13521156962@163.com

張春暉，研究員，研究方向：肉品科學。Email：r_zch@163.com

秦曉潔，沈青山，賈 偉，張春暉，鄭乾坤.超聲輔助脫脂對牦牛骨粉制備及其理化特性的影響[J]. 農業工程學報，2018，34(21)：272－280. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.21.034 http://www.tcsae.org

Qin Xiaojie, Shen Qingshan, Jia Wei, Zhang Chunhui, Zheng Qiankun. Effect of ultrasonic-assisted degreasing on preparation and physicochemical properties of yak bone powder [J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(21): 272－280. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.21.034 http://www.tcsae.org