靜息態fMRI觀察恒河猴慢性酒精暴露模型誘導期后腦功能改變

李 燕，王 松，王海寶，余永強*

(1.安徽醫科大學第四附屬醫院放射科，安徽 合肥 230022；2.安徽醫科大學第一附屬醫院放射科，安徽 合肥 230022)

酒精對腦功能活動的影響一直是臨床和科學研究的熱點，國內已有采用靜息態fMRI評價恒河猴和人類急性期酒精暴露及酒精依賴者腦功能活動改變的研究報道[1-3]，但鮮見對慢性酒精暴露靜息態腦功能活動改變的動態過程研究。本研究建立恒河猴慢性酒精暴露模型，采用3.0T靜息態fMRI，基于分數低頻振蕩幅度(fractional amplitude of low frequency fluctuations， fALFF)算法分析恒河猴慢性酒精暴露模型誘導期后腦功能活動改變，旨在為后續動態研究提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性恒河猴7只[由安徽醫科大學動物實驗中心購于河南省南陽市新野縣新豫野生動物養殖有限公司(豫林護許準[2006]21號)]，年齡6～8歲，平均(7.0±1.0)歲，體質量6.5～17.5 kg，平均(10.79±3.55)kg。實驗動物于恒溫(20℃～22℃)、恒濕(65%)的共同房間中飼養，單只猴籠安置，10 h光照周期(上午8∶00點亮)。

1.2動物模型建立 采用Cosgrove等[4]報道的時間表程序誘導法建立恒河猴慢性酒精暴露模型，藥物為絕對風味伏特加(每瓶700 ml，乙醇濃度為40%)，以蔗糖增甜，并用自來水稀釋，給予實驗動物每日24 h自由口服。乙醇初始濃度為0.2 g/kg體質量，喂養1周，后成倍遞增至第5周(2～5周乙醇濃度分別為0.4、0.8、1.6、3.2 g/kg體質量)，之后按照第5周的濃度維持喂養，第5周喂養完成為誘導期結束。

1.3血液酒精濃度測定 誘導期結束后，fMRI前10 min，經小隱靜脈抽取2 ml靜脈血，以GC 2014C氣相色譜儀(LTSJ-DW-A-001)檢測血液酒精濃度。

1.4fMRI 酒精喂養前行靜息態fMRI獲取基線數據，以3%戊巴比妥鈉(臀部肌肉注射，劑量1.2 ml/kg體質量)麻醉動物，以仰臥位保定于掃描床，監控呼吸，進行BOLD及3D結構像掃描；誘導期結束后再行靜息態fMRI，參數同前。MR掃描前12 h停止酒精喂養，掃描結束后將動物安全送回動物房，清醒6 h后恢復飼食飼水。每次掃描前測量動物體質量。

采用GE Discovery 750W 3.0T MR掃描儀，頭部16通道相控陣正交線圈。BOLD數據采用單次激發EPI序列行全腦軸位掃描，TR 2 000 ms，TE 35 ms，翻轉角90°，FOV 24 cm×24 cm，層厚2.5 mm，層間距0.5 mm，矩陣64×64，層數26層；3D結構像采用快速擾相梯度翻轉恢復序列行軸位掃描，TR 7.2 ms，TE 3.1 ms，翻轉角8°，FOV 25.6 cm×25.6 cm，層厚1.0 mm，無層間隔，矩陣256×256，層數172層。

1.5圖像處理 采用MatLab 7.12(R2011a)dpabi子軟件DPARSF 3.2和SPM12 fMRI數據處理軟件。將DICOM格式的原始圖像轉換為NIFTI格式，移除前10個時間點的數據，進行頭部運動校正，并將數據以Reslice_112RM-SL_T1模板標準化，重新采樣為2 mm×2 mm×2mm的體素元素；然后進行平滑(高斯半高寬3 mm)、非線性漂移和低頻濾波處理，頻率范圍為0.01～0.08 Hz；以Friston24軟件去除協變量，包括去趨勢線、頭部運動參數、腦白質、腦脊液信號等；計算和推導全腦fALFF值，并以MRIcron軟件顯示建模前后fALFF值差異有統計學意義的腦區，并根據猴腦解剖圖和MNI坐標確定差異腦區的具體位置[1]。

1.6統計學分析 采用SPM 12.0軟件對建模前后fALFF進行配對t檢驗，P<0.005(非校正)及簇叢≥5個體素為差異有統計學意義；根據MNI坐標呈現統計學差異的腦區。采用SPSS 19.0統計分析軟件對建模前后實驗動物體質量進行配對樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

對7只恒河猴均成功完成實驗，獲得fMRI數據。建模前實驗動物體質量為(10.79±3.55)kg，酒精暴露誘導期后體質量為(10.64±3.34)kg，差異無統計學意義(t=-0.795，P=0.457)。fMRI前10 min，2只動物的血液酒精濃度分別為0.46、0.49 mg/ml，其余5只動物的血液酒精濃度均<0.01 mg/ml。

與建模前比較，恒河猴酒精暴露誘導期后fALFF值減低的腦區包括左側額中回、左側小腦半球和左側枕下回(簇叢≥5個體素，P均<0.005)，fALFF值增高的腦區包括右側中央前回、右側額中回、右側楔葉、右側枕中回和右側小腦蚓部(簇叢≥5個體素，P均<0.005)，見表1、圖1。

3 討論

隨著影像學檢查設備和軟件的不斷更新，諸多新的成像方法得到開發、應用。靜息態fMRI的出現，使準確描述活體大腦靜息狀態下復雜的功能結構成為可能[5]。BOLD信號與神經血管及血流動力學機制密切相關，對血管活性物質如酒精非常敏感[6-7]。低頻振蕩幅度(amplitude of low frequency fluctuations, ALFF)與區域神經活動成正比，而fALFF對腦灰質更具特異性[8]，可準確描述腦區的自發神經活動。研究[9]表明恒河猴與人類具有相似的默認模式網絡(default mode network, DMN)，在麻醉狀態下仍具有完整的網絡連接。本研究采用靜息態fMRI BOLD信號fALFF算法對恒河猴慢性酒精暴露誘導期后腦功能活動進行觀察。

表1 與建模前比較，恒河猴酒精暴露誘導期后fALFF值差異有統計學意義的腦區

圖1 與建模前比較，恒河猴酒精暴露誘導期后fALFF值差異有統計學意義的腦區

酒精對靜息態腦功能的影響根據給藥方式、給藥量、給藥后檢測時間不同而具有不同的特點。研究[10]表明急性酒精暴露(口服酒精0.65 g/kg體質量，10 min內服下)后30 min，人腦DMN的ALFF、局部一致性(regional homogeneity， ReHo)和功能連接均發生改變，功能連接減弱腦區主要位于左側大腦半球，提示左側大腦半球在靜息狀態下可能對酒精損傷更敏感。本研究中，恒河猴fALFF值減低的腦區均位于左側半腦，推測慢性酒精暴露早期腦功能抑制腦區與急性酒精暴露相似，均位于左側半球。本研究中fALFF值增高腦區均位于右腦，且范圍較廣泛，涉及額葉、枕葉和小腦等，提示慢性酒精暴露早期腦功能激活具有右腦偏側化特點，可能與左半腦血流量減少、功能減弱，而右半腦血流量優勢代償有關，其確切機制有待于進一步深入研究。急性酒精暴露可特異性抑制小腦區域神經元活動，長期大量酒精暴露的神經病理學改變主要見于小腦和額葉，在青少年和年輕人的不成熟大腦中尤為明顯[11]。本研究結果顯示，在慢性酒精暴露誘導期后恒河猴出現左側小腦半球功能活動減低，可能會影響運動控制。

本研究結果顯示，恒河猴雙側額葉在慢性酒精暴露誘導期后即出現功能活動改變，左側減低，右側增加。額葉皮層參與藥物成癮的神經生物學機制[12]，額葉與情感和需求關系密切，可能是酒精濫用甚至成癮作用的重要靶點。慢性酒精暴露下，額葉皮層和島葉皮層中均可觀察到α4β2煙堿型乙酰膽堿受體結合顯著降低[13]。本研究結果顯示，在慢性酒精誘導期動物模型中，雖然酒精攝入量較低，但額葉已經出現多腦區功能活動改變，提示額葉對酒精的敏感性較高。研究[14]表明，在酒精攝入早期，盡管攝入量較低，但其對神經認知功能已產生顯著影響，而酒精長期濫用可導致更嚴重的大腦結構和功能損害。研究[15]表明，在狂飲和酗酒的青少年中，神經結構和活動的改變可能與高塑性神經發育期大量飲酒的神經毒性作用有關。以上研究及本研究結果均提示慢性酒精暴露早期影響額葉腦功能；隨著酒精暴露時間的延長，可能會導致更嚴重的結構和功能損害；額葉為酒精成癮研究的重要的靶點。長時間酒精暴露下，實驗動物模型或人類額葉功能的動態變化有待于繼續研究。

枕葉主要負責視覺處理，酒精對視覺處理中樞的影響明顯而廣泛，楔葉亦參與視覺加工。既往研究[16]表明，酒精會增加視覺網絡中自發BOLD信號波動，提示酒精損害視覺刺激的正常激活響應并影響視覺感知。慢性飲酒會影響青春期雄性恒河猴的視空間聯想記憶功能[17]。本研究結果顯示，在恒河猴酒精暴露誘導期后出現左側枕葉fALFF值減低、右側枕葉和楔葉fALFF值增加，提示視覺皮層可能是酒精誘導神經活動改變的重要靶點。

本研究中，恒河猴慢性酒精暴露誘導期后體質量與建模前差異無統計學意義(P=0.457)，表明動物模型的營養和能量供給均衡，模型建立過程中并未因為酒精攝入而導致能量失衡，體現模型的可行性，可以最大限度降低營養供給失衡對實驗的干擾。且本研究中，MR檢查前10 min，恒河猴體內血液酒精濃度較低，降低了急性酒精暴露對大腦的影響，從而減少對實驗結果的干擾。本研究的不足在于樣本量較小，數據分析和統計方法較單一，有待增加樣本量、改進分析方法等進一步研究。

綜上所述，恒河猴慢性酒精暴露誘導期后靜息態腦功能活動出現明顯改變，表現為左半腦減低，右半腦增強，上述發現為后續建立非人靈長類慢性酒精暴露模型提供了依據，為人類酒精成癮研究提供參考。