迷走復合體和迷走神經在炎癥反應中的可塑性

， ， 王天，

(1. 山東農業工程學院 環境科學與工程學院, 山東 濟南 250100; 2.山東師范大學 生命科學學院, 山東 濟南 250014)

膽堿能抗炎通路是最近發現的一種神經系統與免疫系統相結合的重要的炎癥調節通路，并通過外周迷走神經介導，快速、有效地調節機體局部或全身的炎癥反應[1-2]。該抗炎通路的發現將有利于炎癥發生機制的進一步研究，為臨床上尋求更好的炎癥治療措施提供依據。

膽堿能抗炎通路類似于炎癥反射， 并且有一套完整的反射弧， 包括感受器、 傳入神經、 反應中樞、 傳出神經、 效應器。 迷走神經是一種復合型神經， 既包括迷走傳入神經， 也包括迷走傳出神經， 在中樞與外周免疫系統間起著雙向信息交流的作用。 迷走復合體(dorsal vagal complex，DVC)作為炎癥反射的中樞系統， 主要由迷走神經背核(dorsal motor nucleus of vagus nerve, DMV)和孤束核(nucleus tractussolitarious, NTS)組成。 DMV為迷走傳出神經起始點， 司運動； NTS為迷走傳入神經終止點， 司內臟感覺。 NTS與DMV之間有纖維投射，位置關系緊密。Hermann等[3]研究發現，在炎癥反應過程中，NTS和DMV中Fos陽性神經元數量增加；黃健等[4]研究表明，在炎癥反應過程中，迷走神經放電頻率增大，遞質釋放增多，因此膽堿能抗炎通路參與了炎癥反應。目前，炎癥反應過程中迷走神經放電頻率與NTS和DMV中Fos陽性神經元表達的相關性研究未見報道。

本文中通過制備大鼠內毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)炎癥模型，比較LPS注射后對迷走神經放電頻率和DVC神經元Fos表達的影響，分析DMV和NTS神經元的Fos表達與迷走神經放電頻率的相關性，以進一步探究DVC和迷走神經在炎癥反應調節中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用大鼠為體質量是180～220 g、 品系為Wistar的雄性大鼠，由山東大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(魯)2003-0004。在室溫為(22±2)℃和自然光照條件下單籠飼養。

主要試劑包括：LPS，美國Sigma公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒，北京達科為生物技術有限公司；正常山羊血清(NGS)，江蘇晶美生物科技有限公司；SP試劑盒和顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗Fos抗體SC-52，美國Santa Cruz生物公司。

主要儀器包括：856型冰凍切片機，美國AO Histostat Microtome公司；DG3022A型酶聯免疫檢測儀，華東電子管廠；JS-21型高速冷凍離心機，美國Beckman公司；光學顯微鏡，日本Olympus公司；雙極性黃金電極，成都儀器廠；保溫臺，自制；雷磁PHS-3D型pH計，上海精密科學儀器有限公司；BS200S型電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；BL-420F型生物機能實驗系統，四川成都泰盟儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 LPS炎癥動物樣本的制備

實驗分為生理鹽水對照組和LPS炎癥組2組。

實驗前，LPS組大鼠禁食24 h，自由飲水。實驗開始時，用質量分數為20%的烏拉坦腹腔注射(大鼠每千克體質量注射5 g)麻醉大鼠，仰臥位固定四肢于37 ℃恒溫臺上。左右腹股溝部、左側頸部用眼科剪剪毛，酒精消毒，剪出長度為1～1.5 cm的皮膚切口，分別用玻璃分針分離出右股靜脈(注射藥物)和左股動脈(記錄血壓)并穿線備用[5]，后者用玻璃分針分出左側迷走神經干并穿單線備用。為了避免強烈的聲光和外來電磁干擾對大鼠的刺激，整個實驗過程均在屏蔽室中進行。神經放電和血壓記錄信號穩定后，股靜脈注射質量濃度為2 g/L的LPS(大鼠每千克體質量注射5 mg)。對照組的其他操作同LPS組，股靜脈注射等容量生理鹽水。

1.2.2 迷走神經干放電的測定

輕提棉線將迷走神經干置于極間距為2 mm的雙極黃金電極上[6]，電極的2個夾子分別夾住頸部兩側剪開的皮膚，神經和電極接觸良好即可，不可過松或過緊。黃金電極另一端連接至多通道生理記錄儀記錄神經放電，時間常數、采樣率、濾波范圍分別為0.001 s、 5 kHz/s、 100～1 000 Hz，以注射對照組和LPS組前的放電為基礎放電，在6個時間點記錄放電信號的變化，即LPS注射前以及注射后10、 30、 60、 120、 180 min。

1.2.3 股動脈血壓的測定

分別用動脈夾夾住分離出的股動脈兩端，并在其上剪出一個小切口，將靜脈注射用針頭插入向心端，將針尖緩慢送至動脈夾處，在含有針頭的血管下方繞線并打一個虛結，松開動脈夾，繼續將針頭向前送至0.5～1 cm左右，打成死結。將另一端的壓力換能器接于多通道生理記錄儀記錄血壓變化，采樣率、濾波范圍分別設為5 kHz/s、100～1 000 Hz，最后用計算機進行血壓信號采集并記錄和儲存。

1.2.4 血標本的采集處理及TNF-α含量的測定

配制標準品稀釋液質量濃度分別為1 000、 500、 250、 125、 62.5、 31.3 ng/L共6個濃度梯度。標準孔各加入100 μL以上6個質量濃度的標準稀釋液，樣品孔加100 μL血清，空白孔加入物質的量濃度為0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液作為洗滌液。標準孔、樣品孔、空白孔各加入50 μL稀釋后的生物素抗體(按生物素抗體與水的體積比為1∶1 000進行稀釋)，分別混勻后，封板膜封住，放于37 ℃水浴鍋中90 min，洗板4次；每個孔加入100 μL的鏈親和素辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP，含體積分數為10%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)稀釋液，混勻后，封膜，放入37 ℃水浴鍋90 min，洗板4次。每個孔加入100 μL四甲基聯苯胺(TMB)，于水浴鍋中37 ℃避光溫育5～30 min，每個孔加入100 μL終止液終止反應。在10 min內利用酶標儀檢測波長為450 nm處光密度值。根據6個標準孔和1個空白孔的光密度值，求出標準曲線回歸方程，進而求出樣品孔血清TNF-α的濃度。

1.2.5 延髓腦組織切片制備

腹腔過量注射質量分數為20%的烏拉坦(大鼠每千克體質量注射5 g)處死動物，先用250 mL左右pH為7.4且物質的量濃度為0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液進行心臟灌流，隨后灌入500 mL左右pH為7.4且質量分數為4%的多聚甲醛(PFA)。

腦干剝離、固定、脫水，隨后進行腦干連續恒冷冠狀切片，切片厚度為30 μm，收集于物質的量濃度為0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液中。

1.2.6 Fos蛋白免疫組織化學染色

腦片置于多孔板上，加入孵育液室溫孵育30 min；封閉液室溫處理30 min；加入兔抗Fos抗體在溫度為4 ℃的冰箱中孵育24 h；加入體積分數為25%的生物素標記山羊抗兔IgG室溫孵育2 h；鏈親和素辣根過氧化物酶復合物(含體積分數為10%的Triton X-100)常溫孵育60 min； 二氨基聯苯胺(DAB)處理5～10 min；貼片，復染并封片；神經元Fos顯微照相及處理，統計NTS和DMV陽性神經元在0.01 mm2面積上的個數和平均累積光密度(IOD)值。

1.3 統計學數據處理

采用SPSS 17.0軟件分析數據， 利用t檢驗進行組間比較與組內比較。 若顯著性檢驗水平P<0.05， 則差異顯著；若P<0.01，則差異極顯著。

2 實驗結果

2.1 LPS炎癥對動脈血壓的影響

LPS注射后對動脈血壓的影響見圖1。由圖可知，與對照組相比，LPS炎癥組動脈血壓變化差異不明顯(P>0.05)；LPS炎癥組內毒素注射前及注射后各時間點動脈血壓差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 LPS炎癥對迷走神經放電頻率的影響

LPS注射后對迷走神經放電頻率的影響見圖2、 3。 由圖可知， 分別以注射對照和 LPS 前的放電為基礎放電，對照組中各時間點與基礎放電相比，未見明顯變化(P>0.05)；與其基礎放電相比，LPS組放電頻率明顯增大(P<0.01)；LPS組與對照組相比，注藥后各時間點放電頻率明顯增大(P<0.01)。由此可知，迷走神經通過放電頻率的增大來調節炎癥反應。

圖1 脂多糖(LPS)炎癥時動脈血壓的變化

圖2 脂多糖(LPS)炎癥頸迷走神經各時間段放電變化

*—P<0.05；**—P<0.01，對照組與內毒素炎癥組；#—P<0.05；##—P<0.01，LPS注射前與注射后。

2.3 LPS炎癥對血清TNF-α水平的影響

測得LPS炎癥組血清TNF-α的質量濃度為66.74 ng/L， 對照組血清TNF-α的質量濃度為2.59 ng/L， 因此，相對于對照組，LPS炎癥組TNF-α的質量濃度明顯增大，差異非常顯著(P<0.01)。

2.4 LPS炎癥對DVC神經元Fos表達的影響

LPS炎癥對DMV和NTS神經元Fos蛋白表達的影響結果見圖4。由圖可知，在DMV和NTS中Fos陽性神經元呈棕黃色。

(a)對照組

(b)LPS組圖4 迷走神經背核(DMV)和孤束核(NTS)中Fos蛋白表達結果(放大100倍)

注射LPS后，DVC中NTS和DMV神經元Fos表達統計比較結果見圖5。由圖可知，與對照組相比，LPS組Fos陽性神經元的數量在NTS和DMV均顯著增多(P<0.01或P<0.05)；同時DMV和NTS的Fos陽性神經元表達的強度(AIOD)也均有極顯著增強(P<0.01)。由此推斷，在LPS大鼠炎癥模型中，DVC中的核團NTS和DMV參與了炎癥反應。

3 討論

LPS是多種革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，對宿主有毒性，能夠引起機體免疫刺激的級聯反應和機體的毒性病理生理活動，因此可作為強炎癥誘導物，誘導機體內炎癥細胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α等的合成與分泌，誘導疾病研究的動物模型如炎癥反應，急性肺損傷等[7]。

在LPS炎癥模型反應中， 刺激機體產生炎癥細胞因子， 并進一步誘導各臟器的損傷， 其中TNF-α是誘導組織損傷的最關鍵細胞因子。TNF-α在炎癥反應中作為關鍵啟動因子，與疾病發生程度有明顯的相關性[8]。研究[9]表明，大鼠靜脈滴注LPS，TNF-α水平明顯升高，平均動脈血壓很快下降并出現休克。與本實驗靜脈注射LPS后， TNF-α水平比對照組的顯著升高，動脈血壓降低的結果相一致。

(a)神經元Fos表達

(b)平均光密度*—P<0.05；**—P<0.01，對照組與內毒素炎癥組；DMV—迷走神經背核；NTS—孤束核。

研究[10-14]表明，免疫系統不僅受神經內分泌系統和交感神經系統的調節，還受迷走神經重要的調控作用，已成為近幾年的研究熱點。迷走神經可以直接把外周的炎癥性刺激傳到中樞神經系統，如把膈下迷走神經切斷，可阻斷由腹腔注射IL-1引起的發熱反應[15]。另外，注射LPS所引起的大鼠發熱可通過切斷膈下迷走神經而得到緩解，同時室旁核神經元放電頻率減小[16]。本文中的研究發現，靜脈注射LPS后，迷走神經的放電頻率比對照組的明顯增大，進而可推測通過迷走傳入神經向中樞傳遞的信息增多，或迷走傳出神經從中樞向外周傳遞的沖動增加，說明迷走神經直接參與了炎癥信息的傳遞。最新研究[17-18]表明，頸迷走神經刺激可顯著抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，迷走神經電刺激可活化膽堿能抗炎通路對LPS血癥小鼠腸道上皮和肺的血氣屏障的通透性的保護作用。Thomas等[19]通過缺血再灌注損傷引起的TNF-α增加可通過電生理刺激迷走神經來減少，從而緩解缺血再灌注引起的休克。黃健等[4]發現，夾傷迷走神經干外周端或中樞端并注射LPS后，迷走神經傳入或傳出纖維放電頻率明顯增大，均表明迷走神經參與了機體的抗炎癥反應。

在注射LPS后，可引起下丘腦室旁核和視上核Fos表達增加，而且室旁核隨著注射LPS劑量的增加Fos陽性神經元表達顯著增強[20-23]。Hermann等[3]研究發現，在炎癥反應過程中，NTS和DMV中Fos陽性神經元數量增加與本實驗結果一致，說明迷走神經放電頻率增大向中樞傳遞的沖動增多或中樞興奮性增加向外周傳遞信息增多，引起中樞DVC中核團NTS和DMV的Fos陽性神經元數量增加，進而對膽堿能抗炎癥通路的研究提供了實驗基礎。

4 結論

本文中通過制備大鼠LPS炎癥模型，在迷走神經放電和DVC神經元Fos表達關聯的基礎上，比較LPS注射后對迷走神經放電頻率和DVC神經元Fos表達的影響。結果表明，在炎癥反應中，迷走神經放電頻率增大，NTS和DMV的Fos蛋白表達增強，說明迷走神經可能參與了膽堿能抗炎通路，NTS和DMV可能為膽堿能抗炎通路的低位中樞，通過迷走傳入神經纖維完成對外周信息的接受、處理和整合并將產生的沖動經迷走傳出神經纖維調節炎癥反應。

迷走神經是復合神經，在炎癥反應中是迷走傳入神經纖維放電頻率增加還是迷走傳出神經纖維放電頻率增加的問題值得進一步研究和探討。