表皮生長因子對結腸細胞中緊密連接蛋白表達和磷酸化的影響

黃媛媛，李 靜，李忠穩，夏先明

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC) 是一種腸道疾病，病理特征是炎癥反應和黏膜損害。過度的炎癥反應破壞了腸上皮細胞層的完整性，導致黏膜潰瘍[1]。TJs蛋白差異表達導致的上皮細胞間結構松散或形態變化是UC患者腸黏膜屏障功能降低的主要原因[2]。研究[3]證明，緊密連接(tight junctions，TJs)蛋白的磷酸化會導致上皮細胞的極性改變和結構變化，從而影響上皮屏障功能。TJs蛋白的磷酸化狀態受酪氨酸激酶和絲氨酸-蘇氨酸激酶的調節。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是酪氨酸激酶家族中最重要的激酶，通過其配體表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)的激活，可以調節TJs蛋白的差異表達和磷酸化狀態[4]。該研究觀察T84結腸細胞中TJs蛋白的磷酸化狀況，以及EGF對TJs蛋白磷酸化的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料T84結腸細胞購自美國ATCC細胞中心；小鼠抗claudin-1抗體、小鼠抗claudin-5抗體、兔抗claudin-3抗體、兔抗claudin-7抗體、兔抗occludin抗體、兔抗Zo-1抗體、DMEM/F12培養基等購自美國Invitrogen公司；EGF購自美國Sigma公司；兔抗claudin-3(磷酸化位點Tyr219)抗體、兔抗claudin-5(磷酸化位點Tyr217)抗體、兔抗claudin-7(磷酸化位點Tyr210)抗體等購自美國Assay Biotechnology公司；兔抗β-tubulin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；辣根過氧化物酶結合的二抗購自上海康成生物公司；化學發光HRP底物購自美國Millipore公司。

1.2細胞培養T84細胞傳至8～10代使用。以含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，加入100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，在37 ℃、5% CO2、90%相對濕度的環境中培養。T84細胞培養至單層融合狀態，然后在對照組培養基中加入DMSO (EGF溶劑，100 ng/ml)，實驗組培養基中加入EGF (100 ng/ml)。在干預后24、48、72 h進行細胞遷移檢測或收集T84細胞，用于TJs蛋白的Western blot檢測。

1.3Westernblot檢測從每個樣品中取出20 μg總蛋白，通過4%～20% SDS-PAGE電泳分離，并使用半干轉印系統(Bio-Rad)轉印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜在封閉溶液封閉2 h，加適當比例稀釋的一抗孵育過夜。抗體稀釋濃度：小鼠抗claudin-1抗體、小鼠抗claudin-5抗體、兔抗claudin-3抗體、兔抗claudin-7抗體、兔抗occludin抗體、兔抗Zo-1抗體、兔抗claudin-3磷酸化抗體、兔抗claudin-5磷酸化抗體，以及兔抗claudin-7磷酸化抗體、兔抗β-tubulin抗體等均以1 ∶200比例來稀釋。以PBST洗滌PVDF膜4次。每次15 min，再加辣根過氧化物酶結合的二抗，稀釋比例1︰1 000。最后將免疫復合物用辣根過氧化物酶底物的化學發光劑來顯影，拍照留存。

1.4細胞遷移實驗本實驗使用劃痕的方法來評價EGF對細胞遷移的影響。T84細胞培養至單層融合狀態，并在DMEM/F12(不含胎牛血清)培養基中過夜。用無菌的20 μl加樣槍頭在細胞中央劃痕，再用DMEM/F12洗去漂浮的細胞。劃痕后的對照組培養基中加入DMSO(100 ng/ml)，實驗組培養基中加入EGF(100 ng/ml)。分別于干預后24 h和48 h，在相同的位置用倒置顯微鏡(型號IX71，日本奧林巴斯公司)拍照，評價細胞遷移的速度[5]。

2 結果

2.1EGF對T84細胞TJs蛋白的表達和磷酸化的影響與對照組比較，EGF干預過的T84細胞在48 h后磷酸化claudin-3水平明顯下降(t=7.024，P<0.05)，非磷酸化claudin-3水平升高(t=-6.874，P<0.05)；EGF干預過的T84細胞在24 h和72 h后，非磷酸化claudin-3及磷酸化claudin-3與對照組比較均無明顯變化。見圖1。與對照組比較，EGF干預過的T84細胞在48 h后磷酸化claudin-5水平升高(t=-13.115，P<0.05)，非磷酸化claudin-5水平在72 h后明顯下降(t=5.356，P<0.05)；EGF干預過的T84細胞在24 h后，非磷酸化claudin-5及磷酸化claudin-5與對照組比較均無明顯變化。見圖2。與對照組比較，EGF干預過的T84細胞在48 h后磷酸化claudin-7水平升高(t=-7.116，P<0.05)，非磷酸化claudin-7水平沒有變化；EGF干預過的T84細胞在24 h和72 h后，非磷酸化claudin-7及磷酸化claudin-7與對照組比較均無明顯變化。見圖3。與對照組比較，EGF干預過的T84細胞在48 h后非磷酸化claudin-1水平升高(t=-10.337，P<0.05)；非磷酸化occludin水平在各時間點與對照組相比均無變化；非磷酸化Zo-1水平在EGF干預24 h后高于對照組(t=-10.337，P<0.05)，48 h后與對照組比較，差異無統計學意義，72 h后有所下降(t=-10.987，P<0.05)。見圖4。

2.2EGF對T84結腸細胞遷移的影響劃痕后24 h，EGF干預過的T84細胞和對照組的遷移率分別為(37.48±3.82)%和(21.37±2.35)%，EGF干預組遷移率高于對照組(t=-8.831，P<0.05)，這一趨勢在48 h后更為明顯，EGF干預組和對照組遷移率分別為(50.35±5.43)%和(23.83±2.63)%(t=-11.105，P<0.05)。見圖5。

圖1 Western blot檢測EGF對T84 結腸細胞中claudin-3蛋白磷酸化的影響

圖2 Western blot 檢測EGF對T84 結腸細胞中claudin-5蛋白磷酸化的影響

圖3 Western blot 檢測EGF對T84 結腸細胞中claudin-7蛋白磷酸化的影響

圖4 Western blot 檢測EGF對T84 結腸細胞中claudin-1、occludin、Zo-1蛋白表達的影響

圖5 EGF 對T84 結腸細胞損傷/修復的影響 ×100

3 討論

TJs位于上皮細胞和內皮細胞的頂層結構中，形成一個生理性屏障來調節各種溶質經細胞旁的滲透。TJs蛋白包括claudin亞型、occludin和Zo亞型，是細胞主要的跨膜蛋白，相互之間形成連續的緊密連接束，并以組織特異性的方式相互作用，在上皮細胞間形成電荷和孔道選擇性屏障[6]。文獻[7-8]報道，在實驗性結腸炎模型中，可出現claudin亞型、occludin和Zo亞型的表達下調，并且這種效應常伴有腸上皮層通透性的增加，以及上皮屏障功能的受損。研究[9]表明，蛋白的翻譯后修飾異常與疾病的發生發展關系密切，TJs蛋白的翻譯后修飾包括棕櫚化、O-糖基化和磷酸化。TJs蛋白的磷酸化是調節腸上皮細胞層通透性的重要方法。

某些TJs蛋白亞型適度的磷酸化是維持其生理功能所必須的；不過，TJs蛋白異常磷酸化會改變其彼此間的結合方式，從而影響TJs的聚集和結構的穩定性，使跨上皮細胞層電阻和上皮細胞間通透性發生變化，最終影響到上皮屏障的功能[10]。蛋白激酶C誘導的磷酸化使claudin-3參與裝配TJs的位點減少，導致TJs強度的下降[11]。claudin-5的酪氨酸磷酸化與腦血管內皮細胞層的通透性增加有關，使單核細胞更容易通過損傷的血腦屏障[12]。在腎上皮細胞系，claudin-7磷酸化水平的升高與細胞間氯離子通透性增加有關[13]。TJs蛋白在UC時的磷酸化狀態至今未有文獻報道。

Guntaka et al[14]發現低氧誘導了膽管上皮細胞claudin-3的磷酸化，伴隨TJs結構破壞和上皮屏障功能損傷，應用EGF可以降低claudin-3水平磷酸化，修復膽管上皮屏障。本研究顯示，EGF影響了腸上皮細胞TJs蛋白的表達及磷酸化。與對照組比較，EGF干預過的T84細胞在48 h后磷酸化claudin-3水平明顯下降，非磷酸化claudin-3水平升高，這與文獻報道一致。此外，EGF干預過的T84細胞在48 h后磷酸化claudin-5、claudin-7水平升高，72 h后非磷酸化claudin-5水平明顯下降，非磷酸化claudin-7水平沒有變化。實驗結果表明，EGF 可以調節claudin亞型的磷酸化水平。文獻[15]報道中樞血管內皮細胞中claudin-5、claudin-7的磷酸化與內皮屏障功能受損有關，而本試驗未曾探討病理狀態下T84細胞中TJs蛋白的磷酸化狀況，僅提示EGF 可以調節提高claudin-5、claudin-7的磷酸化水平，其臨床意義有待進一步實驗研究。

本試驗還觀察到，EGF干預過的T84細胞在48 h后非磷酸化claudin-1水平升高，非磷酸化occludin水平在各時間點與對照組相比均無變化，而非磷酸化Zo-1水平在EGF干預24 h后即升高，48 h后與對照組差異無統計學意義，72 h后有所下降。以上結果表明EGF可以調節TJs蛋白的表達。EGF還對細胞劃痕/修復有一定作用，表現為EGF干預過的T84細胞遷移率明顯高于對照組，提示EGF可能有助于腸黏膜損傷的修復，與文獻[16]報道一致。TJs蛋白的磷酸化使得其參與裝配TJs的位點減少[11]，因而細胞間連接功能減弱，細胞遷移功能增強；本研究顯示EGF改變了細胞claudin蛋白的磷酸化狀態，同時促進了上皮細胞的遷移，提示EGF介導的TJs蛋白磷酸化有助于上皮細胞的損傷后修復。

綜上所述，EGF可以影響腸上皮細胞間TJs蛋白的表達和磷酸化狀態，并促進損傷上皮細胞的修復。EGF對UC的治療作用是否與此有關，以及其具體機制，有待進一步探討。