系統性紅斑狼瘡患者抗TPO及抗c-mpl抗體與血小板減少的相關性分析

王維娟，方 璇，厲小梅，汪國生，陶金輝，王 鋼，李向培

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種彌漫性自身免疫性結締組織病，臨床上可累及全身多個系統，血液系統損害較為常見，其中血小板減少是SLE患者常見臨床表現之一。具有明顯出血傾向的血小板減少癥在SLE患者中并不常見，但是嚴重者出現腦出血或消化道出血可危及生命。頑固性血小板減少癥目前仍是臨床治療中的一大難題，是SLE患者預后不良的獨立危險因素[1]。探討SLE血小板減少的致病機制，尋找其有效治療方法尤為重要，目前研究主要集中在多種自身抗體，包括抗血小板抗體、抗血小板生成素(thrombopoietin，TPO)抗體、抗血小板生成素受體(c-mpl)抗體等[2]。TPO是骨髓巨核細胞分化、成熟和釋放血小板的主要細胞因子，通過與靶細胞膜表面特異性受體c-mpl結合發揮其生理作用。但目前未見同時研究TPO、抗TPO抗體及抗c-mpl抗體及其相關性的報道。該研究旨在探討抗TPO抗體及抗c-mpl抗體與SLE患者血小板減少之間的相關性。

1 材料與方法

1.1研究對象選取安徽醫科大學附屬省立醫院風濕科門診或住院的SLE患者共62例,均符合1997年美國風濕病協會制定的SLE診斷標準。其中伴血小板減少SLE患者36例(血小板<100×109/L，A組)，血小板計數4×109/L～98×109/L，平均(58.4±25.5)×109/L；無血小板減少SLE患者26例(B組)，血小板計數101×109/L～370×109/L，平均(184.0±73.6)×109/L。A組36例，男5例，女31例，年齡20～64歲，平均(35.75±10.87)歲，病程1周～240月，平均(53.85±62.29)月。B組26例，男2例，女24例，年齡15～63歲，平均(35.88±11.68)歲，病程1～276月，平均(60.65±74.07)月。健康對照組11例(C組)，男3例，女8例，年齡21～42歲，平均(30.55±7.16)歲，血小板計數正常且無風濕性疾病及血液系統疾病等。三組間性別、年齡匹配，差異無統計學意義(F=2.496,P=0.269；F=1.125,P=0.330)。A、B兩組間病程差異無統計學意義(t=0.392，P=0.697)。所有納入的研究對象符合倫理學標準并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1收集SLE患者的臨床資料 包括年齡、病程、臨床表現等情況，采用系統性紅斑狼瘡活動指數(systemic lupus erythematosus disease index，SLEDAI)評估SLE的疾病活動度。

1.2.2檢測指標 包括血常規、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate， ESR)、C反應蛋白(C reactive protein，CRP)、補體C3、C4、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)、抗雙鏈DNA抗體(anti-dsDNA)等。

1.2.3血清抗TPO抗體、血清抗c-mpl抗體及血清TPO水平檢測 采集靜脈血5 ml，2 000 r/min離心5 min，上清液置于EP管中，-80 ℃冰箱保存待測。采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清TPO水平，按照試劑盒說明書要求進行操作。采用間接ELISA法檢測血清抗TPO抗體及抗c-mpl抗體。具體如下:分別用重組人TPO及c-mpl(美國R&D System公司)以4 mg/L濃度包被ELISA微孔板(美國R&D System公司)，4 ℃過夜，洗滌6次后加入0.05 g/L小牛血清蛋白(美國R&D System公司)封閉非特異性位點，37 ℃溫育1 h，洗滌后每孔位加入100 μl待測血清，洗滌后加入酶標抗體工作液(上海科新生物技術股份有限公司)，洗滌后每孔加入TMB使用液(美國R&D System公司)100 μl，37 ℃溫育20 min后加入稀硫酸終止反應，最后用酶標儀450 nm波長下測定吸光度值。陽性判斷標準：吸光度值大于或等于C組平均值2.1倍及以上。分析其與臨床表現、實驗指標及SLEDAI之間的關系

2 結果

2.1血清TPO水平血清TPO水平在A、B 兩組及健康對照組中分別為(220.30±173.45)ng/L、(149.05±94.49)ng/L和(74.86±25.90)ng/L，三組間差異有統計學意義(F=5.495，P=0.006)，A組明顯高于C組(t=2.751,P=0.009)。

2.2血清抗TPO抗體水平

2.2.1血清抗TPO抗體檢出率 SLE患者中抗TPO抗體總陽性率41.9%(26/62)，在A組、B組和C組的陽性率分別為55.6%(20/36)、23.1%(6/26)和0(0/11)，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，抗TPO抗體在A、B兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2.2血清抗TPO抗體與SLE患者臨床表現和實驗指標的關系 抗TPO抗體陽性者易出現皮疹(P<0.05)；抗體陰性者易出現抗核小體抗體(P<0.05)；抗體陰性組較抗體陽性組APTT、PT均延長，差異有統計學意義(P<0.05)，但兩組APTT、PT數值均在正常范圍內；抗TPO抗體陽性組和陰性組間血小板計數、血清補體C3及C4、ESR、CRP、抗dsDNA陽性率、抗β2-GP1及SLEDAI評分差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1、2。

2.3血清抗c-mpl抗體

2.3.1血清抗c-mpl抗體檢出率 SLE患者中抗c-mpl抗體總陽性率為25.8%(16/62)，抗c-mpl抗體在SLE伴血小板減少組、SLE血小板正常組和健康對照組的陽性率分別為25%(9/36)、26.9%(7/26)和0，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，抗c-mpl抗體陽性率在A、B兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3.2血清抗c-mpl抗體與SLE患者臨床表現和實驗指標的關系 抗c-mpl抗體陽性者易出現皮疹(P<0.05)；抗c-mpl抗體陽性組和陰性組間血小板計數、血清TPO、血清補體 C3及 C4、ESR、CRP、抗dsDNA陽性率、抗β2-GP1、APTT、PT及SLEDAI 評分差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3、4。

2.4SLE患者不同血小板計數間抗TPO抗體、抗c-mpl抗體陽性率比較將SLE血小板減少患者分為三組：Ⅰ組(10例)，血小板<50×109/L；Ⅱ組(16例)，50×109≤血小板<70×109/L；Ⅲ組(10例)，70×109≤血小板<100×109/L，組間比較抗TPO抗體、抗c-mpl抗體差異均無統計學意義(P<0.05)；三組分別與B組比較，Ⅲ組抗TPO抗體陽性率明顯升高，差異有統計學意義(P=0.005)，余兩組抗TPO抗體陽性率差異無統計學意義(P>0.05)；三組抗c-mpl抗體分別與B組比，陽性率差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.5血清TPO、抗TPO抗體、抗c-mpl抗體相關性

2.5.1SLE患者血清TPO、抗TPO抗體、抗c-mpl抗體相關性 SLE患者抗TPO抗體陽性率與抗c-mpl抗體呈正相關(r=0.320，P=0.011)；抗TPO抗體、抗c-mpl抗體均與血清TPO水平無明顯相關性(r=0.054，P=0.677；r=0.035，P=0.787)。

表1 抗TPO抗體陰性組與陽性組臨床表現的比較[n(%)]

表2 抗TPO抗體陰性組與陽性組實驗室指標的比較

表3 抗c-mpl抗體陰性組與陽性組臨床表現的比較[n(%)]

表4 抗c-mpl抗體陰性組與陽性組實驗室指標的比較

2.5.2SLE伴血小板減少患者血清TPO、抗TPO抗體、抗c-mpl抗體相關性 SLE血小板減少患者抗TPO抗體陽性率與抗c-mpl抗體呈正相關(r=0.387，P=0.020)；抗TPO抗體、抗c-mpl抗體均與血清TPO水平無明顯相關性(r=-0.016，P=0.926；r=0.083，P=0.629)。

3 討論

SLE是一種可累及全身多個系統的慢性自身免疫性炎性疾病，血小板減少是SLE患者較為常見的血液系統受損表現，發生率為7%～40%，其中重度難治性血小板減少不足5%[3]。其發病機制尚不明確。TPO是骨髓巨核細胞發育成熟和血小板生成的主要生理性調節因子，其受體c-mpl主要表達在血小板、巨核細胞及CD34+細胞膜上。TPO通過與靶細胞膜上特異性高親和力c-mpl受體結合激活JAK和STAT等信號通路，以誘導巨核細胞分化成熟和促進血小板生成[4]。目前血清TPO水平體內調控機制尚不明確, 多認為主要受巨核細胞數和血小板數及其膜表面c-mpl受體調控，當巨核細胞或血小板數增多時，TPO與c-mpl相結合導致循環血液中TPO含量降低；而當巨核細胞或血小板數減少時，TPO含量升高。多數研究[5-7]顯示，SLE患者體內血清TPO水平較健康對照者明顯升高，而SLE伴血小板減少者更甚。另有研究[8]顯示，SLE患者體內TPO水平升高與其合并血小板減少癥和血栓癥無關，而與白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)和巨噬細胞炎癥蛋白-1α等炎性介質相關。

2000年，Vadhan-Raj et al[9]報道發現了抗TPO 抗體的存在。2002年，Füreder et al[5]采用酶聯免疫分析法(EIA)在SLE患者血清中檢測到該抗體，并發現SLE血小板減少組較SLE血小板正常組抗TPO抗體檢出率高；在血小板減少SLE患者中，抗TPO抗體陽性者血小板下降更明顯，推測可能抗TPO抗體與SLE患者血小板減少相關。2006年，Ziakas et al[6]改良了Füreder的方法，在SLE患者中再次檢測到抗TPO抗體，其檢出率為36.8%(7/19)，并發現該抗體在體外可以抑制巨核細胞的增殖。本研究顯示，SLE患者中抗TPO抗體總的陽性率為41.9%，與既往文獻報道相近。A組較B組抗TPO抗體陽性率升高(P<0.05)，抗TPO抗體陽性者較陰性者血小板計數明顯減少，提示抗TPO抗體與SLE血小板減少有一定相關性。本研究顯示抗TPO抗體陽性組與陰性組血清TPO水平差異無統計學意義，提示該抗體引起血小板減少不僅僅是中和TPO導致骨髓巨核細胞發育分化受到抑制，可能有更多更復雜的機制參與血小板減少。

Kuwana et al[10]報道了SLE患者抗c-mpl 抗體的存在，發現11.6%(8/69)SLE患者及8.3%(7/84)ITP患者檢測出該抗體，而健康者未被檢出。Kuwana et al[2]再次報道了1例合并血小板減少的系統性硬化癥患者血清抗c-mpl抗體陽性，而抗磷脂抗體、抗血小板抗體及抗TPO抗體均陰性，提示血小板減少與該抗體相關。本研究提示，SLE患者抗c-mpl抗體總的陽性率為25.8%，A、B 兩組患者中抗c-mpl抗體的陽性率差異無統計學意義，而健康者體內未檢出，與楊拓 等[7]報道一致。楊拓等[7]發現抗c-mpl抗體陽性組SLE患者血小板計數明顯低于陰性組，而血清TPO水平明顯高于陰性組,推測抗c-mpl抗體可能通過與TPO競爭結合c-mpl阻斷了TPO/c-mpl通路，使巨核細胞分化、成熟障礙，從而引起血小板減少。而本研究得出兩組間血小板計數和血清TPO水平差異雖然無統計學意義，但血清TPO水平陽性組高于陰性組。提示抗c-mpl抗體可能與SLE伴血小板減少相關，可能與本研究樣本量較小、檢測方法等多方面因素影響有關，需要一個更大樣本量、多種檢測方法、多中心研究來進一步驗證。

目前抗TPO抗體及抗c-mpl抗體作用機制尚不完全清楚。羅雄燕 等[11]通過對176例SLE患者骨髓像分析，發現與SLE血小板正常患者相比,SLE血小板減少患者幼稚巨核細胞明顯增多，而巨核細胞總數和產板型巨核細胞均明顯減少，提示SLE血小板減少與巨核細胞增殖分化障礙相關。多數研究[12]顯示抗TPO 抗體陽性者TPO水平下降明顯，該抗體可能通過中和TPO抑制巨核細胞增殖、成熟。TPO通過與巨核細胞膜表面特異性受體c-mpl結合促進巨核細胞成熟和生成血小板。而抗c-mpl抗體與c-mpl結合可抑制巨核細胞發育成熟，從而導致血小板生成減少[13]。抗c-mpl 抗體陽性患者血清TPO水平升高，可能與該抗體與TPO競爭結合c-mpl阻斷了TPO/c-mpl通路，使巨核細胞發育、成熟障礙，從而引起血小板減少[7]。抗TPO抗體及抗c-mpl抗體也可能通過抗原抗體間免疫反應消耗了血小板或者通過殺傷骨髓巨核細胞影響血小板生成。具體機制還有待深入研究。

本研究進一步分析了抗TPO抗體、抗c-mpl抗體與除血小板減少外的其他臨床表現和實驗室指標的關系，結果顯示抗TPO抗體、抗c-mpl抗體陽性者均易出現皮疹，提示出現皮疹的SLE患者容易出現抗TPO抗體和抗c-mpl抗體。抗TPO抗體、抗c-mpl抗體陽性組與陰性組血清補體 C3及 C4、ESR、CRP、抗dsDNA陽性率、抗β2-GP1及SLEDAI 評分差異均無統計學意義。另外本研究顯示SLE患者中抗TPO抗體與抗c-mpl抗體具有相關性，提示SLE患者兩抗體中任何一抗體陽性均易出現另一抗體陽性，兩抗體之間可能具有相互交叉的致病機制，具體機制有待進一步研究。

本研究對SLE伴血小板減少患者抗TPO抗體及抗c-mpl抗體作用做了初步探討，但其具體機制較復雜，需要通過擴大樣本量、多種檢測技術等進一步深入研究。TPO、TPO受體(c-mpl)及其抗體能否用于臨床病情預測、治療評估還需要進行大規模的研究證實，TPO受體激動劑及針對c-mpl及抗c-mpl抗體的生物制劑能否成為SLE血小板減少患者治療的新方向新靶點還有待進一步研究。