人骨形成蛋白7對人牙髓細胞增殖和分化的作用研究

喻 剛，蔣玉清，劉文釗，蘇玲瑜

人牙髓細胞(human dental pulp cells，hDPCs)的主要成分是牙髓成纖維細胞和少量未分化的間充質細胞，其中，未分化的間充質細胞具有多向分化的潛能，在一定條件下可以向成牙本質細胞分化，這對于牙髓組織的損傷修復意義重大[1-2]。人骨形成蛋白(human bone morphogenetic proteins，BMPs)在牙齒發育和牙髓損傷修復中發揮著重要作用。有研究[3]顯示，在動物體內，采用BMP-7(又名成骨蛋白1)與膠原載體復合用于牙齒的直接蓋髓治療，在蓋髓部位可見修復性牙本質形成，表明BMP-7是牙髓修復的潛在治療因子。該研究通過觀察BMP-7對人牙髓細胞增殖和分化的影響，探討BMP-7在人牙髓牙本質復合體損傷修復中的具體作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗試劑 BMP-7購自美國Peprotech公司；DMEM低糖培養基和胎牛血清均購自美國Gibco公司；胰酶、MTT購自Sigma公司；EdU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；礦化誘導液購自Biosharp公司；茜素紅染液和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒購自西安赫特生物科技有限公司；波形絲蛋白(Vimentin)和角蛋白(Keratin)抗體購自英國Abcam公司；FITC標記的熒光二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；cDNA合成試劑盒和qRT-PCR試劑盒均購自美國BIO-RAD公司。

1.1.2實驗儀器 Heraeus BB15型細胞培養箱(美國ThermoFisher公司)；BHC-1000IIA/B3型生物安全柜(中國蘇凈安泰生物技術有限公司)；Sorvall ST16型低速離心機(美國ThermoFisher公司)；IX73型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；Multiscan MK3酶標儀(美國ThermoFisher公司)；ABI7500型熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.2實驗方法

1.2.1人牙髓細胞的收集與原代培養 收集臨床因正畸或阻生拔除的健康前磨牙(30歲以下，無牙體及牙周疾病)，于無菌條件下用含有雙抗的低糖無血清DMEM培養液浸泡并沖洗數遍，劈開牙冠取出牙髓組織，立即用培養基沖洗3遍并充分剪碎，加入2.5 g/L胰酶于37 ℃消化1 h，加入等量含血清培養基終止消化，1 000 r/min離心3 min收集細胞，采用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基重懸并接種細胞，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱培養。每2～3 d換液一次，待細胞融合率達80%后消化并按1 ∶2傳代培養。取2～5代的hDPCs進行Vimentin和Keratin免疫熒光檢測鑒定，并開展后續實驗。

1.2.2EdU細胞增殖檢測 收集對數生長期的hDPCs并接種于96孔板中，次日，向孔中加入終濃度為50、100和200 ng/ml 的BMP-7處理細胞，每個濃度3個復孔，并設置溶劑對照組。將EdU加入各處理組共同孵育36 h以標記增殖細胞，按試劑盒操作說明對細胞進行固定染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3MTT法檢測細胞活力 收集對數生長期的hDPCs并接種于96孔板中，次日，采用1.2.2項下的方法處理細胞。于處理1、3、7、10 d行MTT檢測：向每孔加入20 μl MTT溶液(5 g/L)，在37 ℃孵育2～4 h，再加入50 μl 質量濃度為200 g/L的酸性SDS溶液，于37 ℃溶解甲臜過夜，最后采用酶標儀檢測570 nm波長下的吸光度值。

1.2.4礦化結節檢測 收集2～5代的hDPCs并接種于96孔板中，待細胞貼壁后向孔中加入含50、100、200 ng/ml BMP-7的礦化誘導液(含10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 g/L 維生素C的DMEM培養基)處理細胞，每3 d更換一次誘導液。于處理后的第10天吸出誘導液，采用PBS洗3次，甲醇固定15 min，PBS洗2次，加入茜素紅染液于37 ℃染色30 min，PBS洗3次，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5堿性磷酸酶活性檢測 收集對數生長期的hDPCs并接種于24孔板中，采用1.2.4項下的處理方法誘導細胞。分別于誘導培養后第1、3、7、10天棄去誘導液并裂解細胞，按堿性磷酸酶檢測試劑盒操作說明進行相應處理，并檢測405 nm波長下的吸光度值。

1.2.6實時熒光定量PCR 收集對數生長期的hDPCs并接種于6孔板中，采用1.2.4項下的處理方法誘導細胞，并于誘導培養后第10天進行牙本質基質蛋白(dentin matrix protein 1，DMP-1)和牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)mRNA表達水平的測定：按試劑盒操作說明提取hDPCs總RNA，逆轉錄成cDNA，再進行熒光定量PCR檢測。使用的引物序列如下：DMP-1(forward)：5′-GTGAGTGAGTCCAGGGGAGATAA-3′，DMP-1(reverse)：5′-TTTTGAGTGGGAGAGTGTGTGC-3′；DSPP(forward)：5′-CTGTTGGGAAGAGCCAAGATAAG-3′，DSPP(reve-rse)：5′-CCAAGATCATTCCATGTTGTCCT-3′；GAPDH(forward)：5′-CAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3′，GAPDH(reverse)：5′-CCAAATTCGTTGTCATACCA-3′。以GAPDH mRNA表達水平作為內參，通過檢測目的基因相對于內參基因的表達變化進行定量分析。

2 結果

2.1hDPCs細胞來源鑒定細胞免疫熒光的檢測結果顯示，原代培養的hDPCs細胞Vimentin檢測結果為陽性，胞質內可見明顯的綠色熒光，而Keratin檢測呈陰性(圖1)。該結果表明原代培養的hDPCs來源于中胚層的間充質細胞。

2.2BMP-7對hDPCs增殖的影響如圖2A和2B所示，采用不同濃度的BMP-7(50、100和200 ng/ml)處理hDPCs后，對照組和BMP-7處理組hDPCs中紅色標記的增殖細胞數量差異無統計學意義；此外，MTT細胞活力檢測結果也顯示，采用BMP-處理細胞1、3、7、10 d后，各時間點的BMP-7處理組與對照組相比，hDPCs細胞生長活力差異無統計學意義(P>0.05)，不同濃度BMP-7處理組之間細胞活力也無明顯差異(圖2C)。結果表明，BMP-7對hDPCs增殖無明顯影響。

圖1 細胞免疫熒光鑒定hDPCs 細胞免疫熒光×200

圖2 不同濃度BMP-7對hDPCs增殖的影響 EdU染色×100

圖3 不同濃度BMP-7誘導hDPCs礦化結節形成情況 茜素紅染色×100

2.3BMP-7對hDPCs鈣化結節形成的影響采用含不同濃度BMP-7的礦化誘導液(BMP-7濃度分別為50、100和200 ng/ml)處理hDPCs 10 d后，BMP-7處理組茜素紅染色均呈陽性，可見明顯的礦化結節，且礦化結節的量隨BMP-7濃度的升高而增多(圖3)。

2.4BMP-7對hDPCsALP活性的影響采用含不同濃度BMP-7的礦化誘導液處理hDPCs 3、7、10 d后，BMP-7處理組ALP活性值顯著高于對照組(P<0.01)，且在同一時間點內，ALP的活性隨著BMP-7濃度的升高而顯著增強；隨著作用時間的延長，各處理組ALP的活性也有明顯提升(表1)。

表1 各時間點不同濃度的BMP-7處理組在405 nm處的吸光度值(n=3)

2.5BMP-7對成牙本質相關基因表達的影響采用不同濃度的BMP-7礦化誘導液處理hDPCs 10 d后，各BMP-7處理組DMP-1和DSPP mRNA表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)，且隨著BMP-7濃度的升高，兩種基因的表達水平也有顯著提升(圖4)。

圖4 BMP-7對成牙本質相關基因表達的影響

3 討論

BMP-7屬于TGF-β細胞因子超家族中骨形成蛋白亞家族，又稱為成骨蛋白1，具有多種生物學功能。有研究[4]顯示，BMP -7是一種重要的腎臟調節因子，與腎臟疾病的發生、發展、轉歸密切相關，對維持腎臟的正常結構和功能也有重要意義。此外，BMP-7還具有抑制器官纖維化的作用[5-6]，還可用于誘導骨髓間充質干細胞向神經元細胞分化[7]。而作為一種重要的成骨誘導因子，其主要功能則在促進骨骼的發育和損傷修復方面，諸多實驗和臨床研究[8]表明，BMP-7能促進骨折愈合，并已在臨床上用于多種骨科疾病的治療。同時，在牙髓生物學領域，BMP-7在成牙本質細胞分化和第三期牙本質的形成中具有重要的作用，并能誘導牙乳頭細胞發生功能性分化[3]。林正梅 等[9]采用重組腺病毒介導hBMP-7基因轉染人牙髓細胞，發現與空載體組和未轉染細胞組相比，hBMP-7基因轉染組檢測到了牙髓細胞向成牙本質細胞分化，表明BMP-7在牙髓的損傷修復中也具有重要的調控作用。由此可見，BMP-7在保髓治療中也具有很大的應用前景。

本研究直接采用BMP-7因子處理人牙髓細胞，并運用多種評價指標檢測BMP-7在誘導牙髓細胞增殖及分化中的作用。其中，ALP是評價牙髓細胞早期分化的重要標志物。當牙髓中的未分化間充質干細胞向成牙本質細胞分化時，ALP活性顯著提升。DMP-1在牙本質形成和礦化過程中具有重要作用，它的表達水平可以提示牙髓細胞向成牙本質細胞分化的程度。DSPP是牙本質非膠原蛋白的主要成分，可以作為成牙本質細胞的特異性標記蛋白。結果顯示，經BMP-7處理的hDPCs，細胞增殖無顯著變化，但可形成明顯的礦化結節，且ALP活性呈劑量和時間依賴性地增加，DMP-1和DSPP的表達水平也較對照組顯著提升，進一步證實了BMP-7可以誘導牙髓細胞向成牙本質細胞分化。

BMPs家族蛋白發揮生物學效應的分子機制涉及兩條重要的信號通路：Smads介導的信號通路和MAPK途徑。前者是由靶細胞膜上BMPs受體及細胞質內各型Smads蛋白協同參與完成，是TGF-β超家族包括BMPs信號轉導的經典通路；后者屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要在Smads途徑被阻斷后，作為補救途徑來介導BMPs信號的傳遞[10]。大量研究顯示，BMPs誘導的牙髓細胞分化與兩種信號通路均有關聯。Qin et al[11]的研究顯示，在誘導向成牙本質細胞分化的過程中，BMP-2的加入促進了Smad1/5磷酸化，而采用BMP信號抑制劑Noggin選擇性抑制Smad蛋白活性，則可顯著抑制牙髓細胞的分化，表明Smad1/5在其中發揮了重要的調控作用。Yang et al[12]的研究則發現，BMP-2通過刺激p38 MAPK信號通路，激活了調控干細胞生長的WNT/ β-catenin信號，這一信號級聯也是調控牙髓細胞分化的主要分子機制。此外， Li et al[13]的研究也表明MAPK通路參與了BMP-9誘導牙囊干細胞分化的調控。由此我們推斷，BMP-7誘導牙髓細胞向成牙本質細胞分化也可能受到了Smads信號通路和MAPK途徑的調控。

綜上所述，BMP-7可誘導hDPCs向成牙本質細胞分化，而對hDPCs增殖無顯著影響，其誘導牙髓細胞分化的作用機制可能與BMPs/Smads和MAPK信號通路的調控相關，具體機制有待進一步探討。