褪黑素對PDGF-BB激活的HSCs自噬作用的研究

揭 磊，洪汝濤，張玉潔

肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是肝臟對多種慢性損傷后的共同病理階段，最終發展為肝硬化甚至肝癌[1-2]。目前臨床上尚無很有效治療措施。研究[3]表明，肝纖維化是可以逆轉的。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSCs)在肝纖維化發展中起到關鍵作用[4]。研究[5]表明，PDGF是最強致炎因子之一，PDGF-BB及其受體在HSCs激活中起到關鍵作用。自噬是一種代謝過程，可維持細胞正常功能。研究[6]表明，自噬可激活HSCs，導致肝纖維化。褪黑素是松果體分泌的一種活性物質。課題組前期研究[7-9]表明褪黑素對四氯化碳所致肝纖維化大鼠具有保護作用，其機制可能與抑制TGF-β1/Smad信號通路及抑制HSCs的增殖有關。該課題通過研究HSCs自噬水平及褪黑素干預，進一步探究褪黑素抗纖維化作用。

1 材料與方法

1.1實驗細胞及試劑HSCs系(HSC-T6)(南京凱基生物科技發展有限公司)；褪黑素(美國Sigma公司)；PDGF-BB(美國PeproTech公司)；DMEM高糖培養基(南京Wisent生物公司)；胎牛血清(杭州四季青生物公司)；MTT(美國Sigma公司)；抗α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；抗Beclin1抗體、抗微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain-3,LC3)抗體(美國Abcam公司)；抗β-actin 抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；DMSO、PMSF、青霉素/鏈霉素、胰酶消化酶、BCA試劑盒、PVDF膜(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2細胞培養HSC-T6細胞培養于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱內培養，每隔24 h換液，待細胞融合至70%～80%時傳代，并取對數生長期細胞進行相關實驗。按實驗需求，將細胞分為5組，即：模型組及實驗組(3組)加入PDGF-BB(10 ng/ml)[10]，實驗組分別加入不同濃度的褪黑素(1 nmol/L、 1 μmol/L、0.1 mmol/L)。對照組加入等量PBS。

1.3MTT實驗取對數生長期HSC-T6細胞，經胰酶消化后，置于DMEM重懸，調整細胞濃度為5×103個/孔，接種于96孔板內，每孔200 μl。分為5組：對照組、模型組、實驗組(褪黑素1 nmol/L、1 μmol/L、0.1 mmol/L組)，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱內培養24 h后，更換為無血清培養基培養，除對照組外，其余各組均加入PDGF-BB(10 ng/ml)作用30 min，后在實驗組分別加入相應濃度的褪黑素，對照組加入等體積的PBS。藥物作用48 h后棄去上清液，加入MTT(5 mg/ml)作用4 h。后棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO,將96孔培養板置于搖床上震蕩10 min，用酶標儀檢測490 nm波長處各孔吸光度(optical density，OD)值。

1.4Westernblot實驗取對數生長期HSC-T6細胞消化后接種于培養瓶，恒溫培養箱內培養24 h后，除對照組外，其余各組均加入PDGF-BB(10 ng/ml)作用30 min，在實驗組加對應濃度的褪黑素，對照組加等體積PBS。作用48 h后提取總蛋白，利用BCA法予以蛋白定量，取10 μl樣品上樣電泳，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉移到PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h ，用PBS洗5 min×3次，加抗α-SMA、Beclin1、LC3、血小板衍生生長因子受體-β(platelet derived growth factor receptor-β,PDGFR-β) 一抗(1 ∶2 000)，抗β-actin一抗(1 ∶3 000)，置于4 ℃冰箱過夜，次日室溫孵育30 min后用PBST洗滌 10 min ×3 次，加二抗(1 ∶80 000)，室溫孵育1.5 h后，用PBST洗滌 10 min ×3 次，加ECL顯色液顯影。β-actin 作為內參，用IPWIN 6.0軟件分析結果，蛋白表達水平以目的蛋白/β-actin的平均灰度比值表示。

2 結果

2.1褪黑素對PDGF-BB激活的HSC-T6細胞增殖的影響MTT結果顯示，與對照組相比，PDGF-BB激活了HSCs，促進其增殖，差異有統計學意義(P<0.01)。與對照組相比，褪黑素可抑制HSCs的增殖。見表1。

表1 褪黑素對PDGF-BB激活的HSC-T6細胞增殖的影響

與對照組比較:**P<0.01;與模型組比較:##P<0.01

2.2褪黑素對HSC-T6細胞α-SMA表達的影響Western blot結果顯示，相對于對照組，PDGF-BB激活的HSC-T6細胞α-SMA表達水平增高，差異有統計學意義(F=13.954，P<0.05)；而相對于模型組，褪黑素可降低HSC-T6細胞α-SMA的表達(F=13.954，P<0.05)。見圖1。

A：對照組；B：模型組；C：褪黑素1 nmol/L組；D：褪黑素1 μmol/L組;E:褪黑素0.1 mmol/L組；與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.3褪黑素對HSC-T6細胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達的影響Western blot結果顯示，在PDGF-BB激活的HSC-T6細胞中，Beclin1蛋白和LC3Ⅱ蛋白表達水平相對于對照組明顯增加(F=6.205、48.283，P<0.05)；相對于模型組，在褪黑素干預的各治療組中，Beclin1蛋白和LC3Ⅱ蛋白表達顯著減低(F=6.205、48.283，P<0.05)。見圖2。

2.4褪黑素對HSC-T6細胞PDGFR表達的影響Western blot結果顯示，在PDGF-BB激活的HSC-T6細胞中，PDGFR表達相對于對照組顯著增高(F=18.848，P<0.01)；相對于模型組，褪黑素干預的HSC-T6細胞中，PDGFR表達明顯降低(F=18.848，P<0.05)。見圖3。

3 討論

肝纖維化是肝臟受到慢性損傷時產生多種炎癥介質，激活HSCs，產生大量細胞外基質的病理過程。該過程中，肝實質細胞被纖維組織所替代，最終發展為肝硬化，甚至肝癌，嚴重威脅人類健康。相關研究[3]表明，肝纖維化發生發展過程中，經適當的干預，其病理過程可被阻止，甚至逆轉。因此，積極開發安全有效的抗肝纖維化藥物有重要的臨床意義。

圖2 褪黑素對Beclin1蛋白及LC3Ⅱ蛋白表達的影響

A：對照組；B：模型組；C：褪黑素1 nmol/L組；D：褪黑素1 μmol/L組;E:褪黑素0.1 mmol/L組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

褪黑素具有抗炎抗氧化作用，同時也有抗纖維化作用。Lebda et al[11]結果顯示，褪黑素可抑制炎癥介質的分泌、對抗氧化應激、抑制纖維化進程等，從而起到抗肝纖維化作用。González-Fernández et al[12]研究表明，褪黑素具有抗纖維化作用，可能與抑制鞘氨醇激酶1-1-磷酸鞘氨醇(SphK1-S1P)信號通路有關。此外，本課題組前期研究[7-9]表明，褪黑素具有抗纖維化作用，可能與其抗氧化、抑制TGF-β/Smad信號通路有關。本實驗通過體外培養HSCs，以PDGF-BB激活及褪黑素干預，通過MTT法及Western blot法檢測HSCs增殖、激活及其自噬表達水平，結果表明，褪黑素可抑制HSCs增殖及激活，可能是通過抑制HSCs內自噬水平發揮作用。

HSCs是一種間質細胞，存在于肝臟狄氏間隙。正常情況下，HSCs處于靜止狀態；但當肝臟受到損傷產生炎癥介質時，如TGF-β、PDGF等，HSCs被激活，轉化為肌成纖維樣細胞(myofibroblast cells,MFC),分泌大量細胞外基質，進而促使肝纖維化的發展。其中，α-SMA是HSCs激活的標志。目前，一些研究將抑制HSCs的激活作為抑制肝纖維化的靶點。本實驗結果表明褪黑素可能通過抑制HSCs的激活和增殖發揮抗肝纖維化作用。

圖3 褪黑素對PDGFR蛋白表達的影響

A：對照組；B：模型組；C：褪黑素1 nmol/L組；D：褪黑素1 μmol/L組;E:褪黑素0.1 mmol/L組；與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

自噬是廣泛存在于人體的一種代謝過程。人體的衰老細胞器、內膜等被自噬體吞噬，轉運至線粒體，維持細胞新陳代謝。有研究[13]表明，自噬可促進HSCs的激活，導致肝纖維化。靜息狀態下，HSCs中含有大量脂滴及維生素A，為HSCs未被激活的標志。而在HSCs被激活時，細胞內的自噬體可吞噬脂滴，轉運至線粒體進行β氧化，為HSCs的活化及其分泌大量膠原蛋白等提供能量。Shen et al[14]試驗結果表明，蝦青素可抑制HSCs的活化，其作用機制可能與蝦青素抑制HSCs內自噬的水平有關。本實驗結果表明，褪黑素可能通過抑制HSCs內自噬水平從而抑制其激活及增殖。

在HSCs激活過程中，PDGF-BB/PDGFR-β信號通路扮演重要角色。PDGF-BB與其受體PDGFR-β結合，啟動該信號通路，誘導肝纖維化的發展。且在慢性肝損傷中，PDGF-BB 和 PDGFR-β的表達相對于正常肝組織明顯增加[15]。有研究[10]表明，PDGF-BB能激活HSCs并促進其增殖。本實驗結果表明，褪黑素干預可能通過抑制PDGF-BB/PDGFR-β信號通路而抑制HSCs激活及增殖。

綜上所述，本實驗利用PDGF-BB激活HSCs，結果顯示，PDGF-BB能激活HSCs、促進其增殖，該作用可能與PDGF-BB啟動PDGF-BB/PDGFR-β信號通路，上調HSCs的自噬水平有關；而褪黑素可抑制HSCs的激活及增殖，其機制可能與褪黑素抑制PDGF-BB/PDGFR-β信號通路，進而抑制HSCs內自噬水平有關。這為肝纖維化的治療提供新的思路。