IL-17調控PI3K/AKT/FAS/FASL信號通路抑制Hep-2細胞凋亡

楊 明，宋 楊，張紅健，季加標，楊見明

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其發病率占頭頸部腫瘤的三分之一，病理類型以鱗狀細胞癌為主[1]。臨床上喉癌的治療主要以手術治療或者手術聯合放化療為主，患者的喉功能如吞咽、發音功能受到不同程度的影響，并降低患者生活質量，研究新的治療方案如免疫治療對此類患者具有很大的前景[2]。白介素-17(interleukin-17，IL-17)是一種由CD4+ T Th17細胞、γδT 細胞、自然殺傷T細胞(NKT)、TCRβ+ Th17細胞分泌的促炎細胞因子[3]。IL-17在腫瘤免疫中發揮重要作用， 研究[4]表明IL-17通過促進腫瘤血管生成促進腫瘤生長和轉移。研究[5]顯示IL-17可以抑制Lewis 肺癌荷瘤小鼠MDSCs細胞(髓系來源的抑制細胞)的凋亡。課題組前期研究[6]結果表明IL-17可以通過調控IL-6/IL-6R/JAK1/STAT3信號通路影響喉癌細胞的侵襲和轉移。然而IL-17對喉癌細胞凋亡的影響及其具體機制查閱國內外相關文獻尚未見報道，該研究在前期研究基礎上，重點研究IL-17對喉癌細胞凋亡的影響及體外機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養上皮樣細胞Hep-2細胞，屬于人源性高分化喉癌細胞系，呈單層貼壁生長狀態，購自南京凱基生物科技發展有限公司。常規細胞培養基(RPMI 1640+10%胎牛血清+100 mg /L青霉素+100 mg/L 鏈霉素)培養Hep-2細胞，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱孵育，1～2 d傳代或者換液一次。

1.2試劑200-17(IL-17刺激劑，對IL-17具有生長刺激作用)購自美國PEPROTECH公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；RPMI1640培養液購自美國HyClone公司；抗PI3K單克隆抗體、抗p-PI3K抗體購自美國Abcam公司；抗Fas抗體、抗FasL抗體、抗AKT抗體、抗p-AKT抗體購自美國CST公司；抗β-actin 抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購自美國ABclonal公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；BCA法蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、蛋白 Marker、胰酶、一抗稀釋液、二抗稀釋液、ECL熒光劑(顯影劑)均購自上海碧云天生物有限公司。

1.3儀器NAPCO-8800型恒溫細胞培養箱購自美國SHELLAB公司；SW-9800型超凈工作臺購自蘇州泰安空氣技術有限公司；Western blot電泳儀(Tanon)購自上海天能科技有限公司；CytoFLEX流式細胞儀購自美國BECKMAN COULTER公司。GraphPad Prism 6圖像處理軟件；Image-Pro plus 圖像處理系統。

圖1 流式細胞術檢測IL-17對Hep-2細胞凋亡的影響

1.4AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測將Hep-2細胞消化后以相同的量接種到6孔板中(接種6孔，每孔細胞數為1×106)，待細胞貼壁后，棄去培養液，用PBS洗2次，對照組加入RPMI1640，實驗組加入含50 ng/ml 200-17的RPMI1640，分別處理6、12、24 h后胰酶消化細胞，收集至15 ml 離心管中，300 g 4 ℃ 離心5 min，棄去上清液， 用400 μl PBS 洗滌2次，Annexin V-FITC/PI 雙熒光(FITC 50 mg/L， PI 50 mg/L) 避光染色 10 min，CytoFLEX流式細胞儀檢測，CytExpert分析軟件分析檢測結果。

1.5Westernblot法檢測不同濃度200-17刺激Hep-2細胞后PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Fas、FasL蛋白表達的變化將對數生長期的Hep-2細胞消化后以相同的量接種6孔板中(接種四孔，每孔細胞數大約為1×106)，待細胞貼壁后，棄去培養液，用PBS洗2次，在4個孔中分別加入含不同濃度200-17(0、1、50、100 ng/ml)的RPMI1640處理6 h，棄去培養液，4 ℃預冷PBS清洗細胞，培養板中加入蛋白裂解液(含PMSF及磷酸化酶抑制劑)充分裂解細胞，13 000 r/min 4 ℃離心20 min,吸取上清液；BCA試劑盒檢測蛋白濃度后分裝保存。根據測定的蛋白濃度加入相應體積的總蛋白樣品和5×loading buffer(比例為4 ∶1)，混勻后在干浴鍋中100 ℃煮10 min，蛋白變性后的樣本于-20 ℃冰箱中保存。每泳道加20 μg蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳；分離凝膠中的蛋白并轉移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫搖床上封閉2 h。TBST 洗滌4次，每次5 min，分別與抗PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Fas、FasL、β-actin抗體4 ℃下孵育過夜。TBST洗滌4次，每次5 min，將膜置于相對應二抗內室溫搖床下孵育1 h，TBST 洗滌5 min×4次后，ECL化學發光底物顯影檢測蛋白。用Image-Pro plus圖像處理系統分析計算Western blot灰度值。

2 結果

2.1IL-17刺激不同時間后Hep-2細胞的凋亡率通過Annexin V-FITC/PI雙染法檢測200-17作用6、12、24 h后Hep-2細胞的凋亡率。結果顯示，對照組和實驗組凋亡率逐漸增高，與對照組相比，加50 ng/ml 200-17作用6、12、24 h后，Hep-2凋亡率均降低，200-17作用6 h后與對照組比較，實驗組Hep-2細胞凋亡率降低最明顯。6 h對照組凋亡率為(12.56±2.51)%，6 h實驗組凋亡率為(2.47±0.96)%，12 h對照組凋亡率為(26.79±1.48)%，12 h實驗組凋亡率為(19.79±2.16)%，24 h對照組凋亡率為(32.35±1.3)%，24 h實驗組凋亡率為(24.10±1.17)%。采用t檢驗比較，差異有統計學意義(t=4. 629，P<0. 01)。見圖1。

2.2不同濃度200-17刺激Hep-2細胞時PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Fas、FasL蛋白的表達用不同濃度(0、1、50、100 ng/ml)的200-17刺激Hep-2細胞，隨著200-17濃度的升高，Hep-2細胞中p-PI3K、p-AKT蛋白的表達逐漸增加，差異有統計學意義(P<0.01)；PI3K、AKT蛋白表達差異無統計學意義。與0 ng/ml組相比，1、50、100 ng/ml組200-17刺激后Hep-2細胞內Fas、FasL蛋白表達降低(t=-3.258、-2.738，P<0.01) 。隨著200-17濃度升高，FasL表達逐漸降低；與對照組、1 ng/ml組相比，100 ng/ml組Fas蛋白表達降低，然而與50 ng/ml組相比，Fas表達增高(t=-4.247，P<0.01)。見圖2。

圖2 不同濃度IL-17刺激下Hep-2細胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、FAS、FASL分子表達的變化

1：0 ng/ml 200-17組；2：1 ng/ml 200-17組；3：50 ng/ml 200-17組；4：100 ng/ml 200-17組；與0 ng/ml 200-17組比較：**P<0.01

3 討論

喉鱗狀細胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，占全身惡性腫瘤的1%～2.5%[7]。目前喉癌的主要治療方法包括手術、放療、手術聯合放療/化療的綜合治療[2]。手術治療后患者發音功能重建效果不佳，部分患者喉功能完全損失，對患者生存質量造成較大影響，開發新的治療方案如免疫治療非常有必要[8]。

IL-17是一種由多種細胞分泌的促炎細胞因子， IL-17與其受體結合后，可以作用于巨噬細胞、T細胞、上皮細胞、內皮細胞等多種細胞，誘導IL-6、IL-1β、TNF-α等多種促炎因子和CXCL-1、 CXCL-8、 CXCL-10、MCP-1等趨化因子從而發揮促炎作用，同時IL-17與自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤的發生發展密切相關[9-10]。研究[9]表明IL-17通過激活Src/PI3K/Akt/nuclear factor-κB (NF-κB)、MAPK、 Stat3、COX-2信號通路在調控腫瘤生長、參與腫瘤血管生成及侵襲與轉移中發揮重要作用。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-絲氨酸蘇氨酸激酶(AKT)信號通路與腫瘤的發生發展密切相關，是與細胞增殖和細胞凋亡關系最密切的信號通路之一，并有望成為惡性腫瘤治療的新靶點[11]。頭頸部腫瘤中PI3K信號通路的異常激活能促進腫瘤的異常增殖及腫瘤的發生發展[11-12]。研究[13]顯示在星形膠質瘤細胞中IL-17能夠激活PI3K/AKT信號通路。本研究用不同濃度IL-17刺激Hep-2細胞后，采用Western blot分析PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達，結果顯示，采用不同濃度(0、1、50、100 ng/ml)IL-17處理Hep-2細胞6 h后，隨著濃度增加，p-PI3K、p-AKT表達逐漸增加，呈濃度依賴性。提示IL-17能夠激活Hep-2細胞中PI3K/AKT信號通路。

Fas和FasL(Fas配體)分別是腫瘤壞死因子(TNF)受體和TNF家族成員，Fas介導的凋亡途徑是腫瘤細胞凋亡的主要途徑之一，Fas與FasL的結合導致caspase級聯反應進而導致細胞凋亡[14]。Fas介導的凋亡途徑在免疫監視和維持體內平衡中起關鍵作用，并且是藥物誘導的凋亡的介質[14]。研究[15]顯示磷酸化AKT能夠活化Forkhead家族成員FOXO轉錄因子，下調FasL誘導的凋亡過程。Western blot結果顯示，與對照組相比，實驗組p-AKT表達逐漸增加，Fas、FasL表達降低，此結果支持磷酸化AKT下調FasL的表達從而下調Fas介導的凋亡途徑的觀點。與對照組、1 ng/ml組比較，100 ng/ml組Fas蛋白表達降低，然而與50 ng/ml組相比，Fas表達增高，考慮可能與Fas的表達在200-17濃度為50、100 ng/ml時進入平臺期有關[16]。采用流式細胞術檢測細胞凋亡，結果顯示，與對照組相比，采用50 ng/ml 200-17處理Hep-2細胞6、12、24 h后，Hep-2細胞凋亡率減少。結合以上，本研究的結果提示，IL-17可以抑制Hep-2細胞凋亡。