肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的檢測(cè)及基因型分析

董大光，王 健，潘亞萍，沈繼錄，徐元宏

肺炎克雷伯菌是臨床分離及醫(yī)院感染的重要致病菌之一，隨著β-內(nèi)酰胺類(lèi)及氨基糖苷類(lèi)等廣譜抗菌素的廣泛使用，細(xì)菌易產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和頭孢菌素酶以及氨基糖苷類(lèi)修飾酶，尤為嚴(yán)重的是對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)的持續(xù)增加[1-2]，給臨床抗感染治療帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。該文收集了25株CRKP，對(duì)耐藥性、耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)以及流行狀況進(jìn)行了初步分析，以探究CRKP的耐藥機(jī)制及其流行情況。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象 收集2016年1月～12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院分離的25株對(duì)碳青霉烯類(lèi)具有很強(qiáng)耐藥性的肺炎克雷伯菌，將之作為本次研究的對(duì)象，并且做到同一個(gè)患者沒(méi)有重復(fù)分離株。采用質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922。

1.1.2儀器 全自動(dòng)的Vitek 2 Compact微生物系統(tǒng)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜均購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；GeneAmp970基因擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)PE公司。

1.1.3試劑 血平板、麥康凱平板、MH平板等培養(yǎng)基購(gòu)自合肥天達(dá)診斷試劑有限公司；藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；亞胺培南粉末購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)國(guó)瑞藥業(yè)有限公司；細(xì)菌蛋白抽提液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.4引物 標(biāo)志物DL2000、Ex Taq DNA聚合酶試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖、引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物序列：F：5′-TCTGGACCGCTGGGAGCTGG-3′；R：5′-TGCCCGTTGACGCCCAATCC-3′。片段大小為510 bp。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)采用VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，部分藥物補(bǔ)充K-B法，具體標(biāo)準(zhǔn)參照CLIS 2016推薦的方法。

1.2.2產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌表型篩選

1.2.2.1改良Hodge試驗(yàn)(modified Hodge test，MHT) 把0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c桿菌ATCC 25922的懸浮液1 ∶10稀釋后均勻涂布于藥敏試驗(yàn)平板上。于平板正中央貼10 μg/片美羅培南藥敏紙片，將待測(cè)菌挑取出來(lái)，自紙片外緣向平板邊緣劃線(xiàn)接種待檢菌，經(jīng)35 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后判定效果。

1.2.2.2Carba NP(Carbapenemase Nordmann-Poirel)試驗(yàn) 制備A液(含0.1 mmol/L硫酸鋅的酚紅溶液)和B液(A液中加入6 mg/ml 亞胺培南)。分別標(biāo)記1.5 ml離心管為a、b，每管中加入100 μl 細(xì)菌蛋白抽提液，從37 ℃培養(yǎng)24 h血平板上挑取受試菌株，振蕩混勻5 s，a管中加入100 μl A液，b管中加入100 μl B液，渦旋振蕩混勻，置于37 ℃孵箱，每0.5 h觀察記錄顏色變化至孵育2 h結(jié)束。

1.2.2.3改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(modified Carbapenem inactivation method，mCIM) 取1 μl接種環(huán)的過(guò)夜培養(yǎng)純菌落于2 ml TSB肉湯中，震蕩混勻，每管菌懸液放入一張含10 μg美羅培南的無(wú)菌紙片，(35±2) ℃孵育4 h后，用0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c埃希ATCC 25922菌懸液(直接菌懸法)涂布平板，干燥3～10 min，將美羅培南紙片從TSB肉湯中取出貼于已涂布有大腸埃希菌ATCC25922的MH平板上。倒置平板，孵育18～24 h后量取抑菌圈直徑。

1.3金屬酶表型EDTA協(xié)同試驗(yàn)準(zhǔn)備MH藥敏瓊脂平皿和待測(cè)菌，將過(guò)夜待測(cè)菌用無(wú)菌生理鹽水調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海瑢⒕壕鶆蛲坎加贛H平皿上，靜置10 min待干燥，將10 μg/片亞胺培南貼在MH平皿上，距其1 cm處貼一張EDTA(吸附有0.5 mol/L EDTA 10 μl)紙片。35 ℃培養(yǎng)18 ～24 h后觀察結(jié)果。

1.4產(chǎn)肺炎克雷伯菌型碳青霉烯酶基因檢測(cè)采用煮沸裂解法提取總DNA為模板。blaKPC基因擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，如此循環(huán)33次；最后在72 ℃下延伸5 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。上海生工公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.5耐藥菌株同源性分析煮沸法制備細(xì)菌DNA，ERIC-PCR的引物序列ERIC1：ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC；ERIC2：AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。擴(kuò)增條件是：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，如此循環(huán)20次，接著94 ℃變性1 min, 42 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，如此循環(huán)35次，最后在72 ℃延伸5 min。取出擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，加入到1.5%瓊脂糖凝膠里，開(kāi)始電泳分析。判定標(biāo)準(zhǔn)為主要的條帶位置和數(shù)量相同為同一基因型。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用WHONET 5.6軟件對(duì)K-B法的藥敏結(jié)果和儀器法最小抑制濃度(MIC)藥敏結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果

2.1藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果所分離的25株肺炎克雷伯菌中，復(fù)方新諾明和米諾環(huán)素的耐藥率較低，分別為28%和4%。其他抗生素(頭孢菌素、喹諾酮類(lèi)、青霉素類(lèi)、青霉素/青霉素酶抑制劑、氨曲南等)均高度耐藥。見(jiàn)表1。

表1 25株耐碳?xì)涿割?lèi)菌對(duì)18種抗菌藥物的耐藥率

2.2MHT試驗(yàn)、CarbaNP試驗(yàn)和mCIM試驗(yàn)結(jié)果對(duì)25株肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型檢測(cè)，3種試驗(yàn)結(jié)果相同，24株CRKP陽(yáng)性，陽(yáng)性率為96%，陰性株為同一標(biāo)本。見(jiàn)圖1～3。

2.3EDTA協(xié)同試驗(yàn)亞胺培南-EDTA協(xié)同試驗(yàn)檢測(cè)25株耐藥菌株的金屬酶表型，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性菌株。見(jiàn)圖4。

圖1 改良Hodge試驗(yàn)碳青霉烯酶檢測(cè)結(jié)果

1：陽(yáng)性質(zhì)控菌ATCC BAA1705；2：陰性質(zhì)控菌株ATCC BAA1796；3、4：受試菌株，陽(yáng)性結(jié)果

圖2 Carba NP試驗(yàn)碳青霉烯酶檢測(cè)結(jié)果

圖3 改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)碳青霉烯酶檢測(cè)結(jié)果

圖4 EDTA協(xié)同試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.4KPC酶基因檢測(cè)結(jié)果24株碳青霉烯酶表型試驗(yàn)陽(yáng)性的CRKP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序?qū)Ρ?，結(jié)果顯示均為KPC-2型基因，1株碳青霉烯酶表型檢測(cè)的陰性株KPC酶基因檢測(cè)結(jié)果為陰性。見(jiàn)圖5。

2.5ERIC-PCR基因分型25株CRKP主要分為8型，其中Ⅰ型3株，Ⅱ型最多共14株，Ⅲ型和Ⅶ型各2株，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ型各1株。見(jiàn)圖6。

圖5 部分臨床菌株KPC基因電泳圖

M：Marker；8號(hào)株的KPC基因陰性，其他菌株均為陽(yáng)性

圖6 部分臨床菌株ERIC-PCR基因分型圖譜

M：Marker；1、2、9為Ⅰ型；3、4、5、8、12、13、15、17為Ⅱ型；6、7為Ⅲ型；10為Ⅳ型；11為Ⅴ型；14為Ⅵ型；16為Ⅶ型

3 討論

肺炎克雷伯菌在臨床和醫(yī)院感染中是重要的致病菌，對(duì)外界有強(qiáng)烈的抵抗力。我院25株CRKP藥敏結(jié)果顯示，復(fù)方新諾明的敏感率為72%，對(duì)米諾環(huán)素的敏感率為92%，其他抗菌藥物均高度耐藥。提示CRKP常常伴隨對(duì)其他抗生素也耐藥，形成多重耐藥，給臨床抗感染治療帶來(lái)極大困難，而臨床治療CRKP感染可以選用四環(huán)素類(lèi)抗生素和復(fù)方新諾明。

CLSI在2009年推薦了MHT試驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶的表型，是一種常規(guī)的方法。2015年時(shí)，CLSI引進(jìn)了Carba NP試驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)除可用于檢測(cè)腸桿菌科，還可以檢測(cè)銅綠假單胞菌和不動(dòng)桿菌屬碳青霉烯酶的表型[3]。mCIM是由Van et al[4]發(fā)現(xiàn)的快速檢測(cè)碳青霉烯酶的實(shí)驗(yàn)，并于2017年CLSI新指南推薦采用mCIM檢測(cè)碳青霉烯酶。它們共同優(yōu)點(diǎn)在于使用簡(jiǎn)便，并且成本很低，檢測(cè)具有很高的準(zhǔn)確率，因此，適合臨床微生物室開(kāi)展，被廣泛用于檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌。唐海玲 等[5]通過(guò)與PCR法比較，用Carba NP試驗(yàn)方法，篩查多重耐藥革蘭陰性桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶，具有97.06%的敏感性和100%特異性，效果很好。同時(shí)文獻(xiàn)[6]也表明Carba NP試驗(yàn)在檢測(cè)KPC、NDM、VIM、IMP、SPM和SME型碳青霉烯酶方面具有較好的敏感性(>90%)和特異性(>90%)。Tijet et al[7]用mCIM與Carba NP兩種方法檢測(cè)182株腸桿菌科細(xì)菌，兩者均可有效地檢測(cè)出碳青霉烯酶。余佳佳 等[8]用mCIM，以154株臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌為對(duì)象，篩查出了產(chǎn)碳青霉烯酶的細(xì)菌，將其與MHT結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，mCIM具有符合率和特異性高、結(jié)果易于觀察等優(yōu)勢(shì)。該實(shí)驗(yàn)25株CRKP分別進(jìn)行Hodge、Carba NP和 mCIM試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組試驗(yàn)結(jié)果相同，有24株陽(yáng)性，占總數(shù)的96%，非常接近儲(chǔ)雯雯 等[9]報(bào)道的陽(yáng)性率93.2%。碳青霉烯酶篩選試驗(yàn)陽(yáng)性的24株CRKP進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳分析，共出現(xiàn)23個(gè)目標(biāo)帶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果都是KPC-2型耐藥基因，1株P(guān)CR陰性的菌株耐藥機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

MHT試驗(yàn)不足之處是其特異度表現(xiàn)上不夠，尤其在弱陽(yáng)性菌株檢測(cè)時(shí)，很難分析Hodge試驗(yàn)的結(jié)果。Carba NP試驗(yàn)可以快速檢測(cè)碳青霉烯酶的表型，但需要特殊的試劑以及無(wú)法檢測(cè)某些碳青霉烯酶(如染色體編碼的OXA型碳青霉烯酶)，在檢測(cè)OXA-232型碳青霉烯酶存在一定的假陰性。且目前CLSI只有腸桿菌科細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)的mCIM。同種細(xì)菌在金屬酶的特異性作用下可能會(huì)出現(xiàn)不同的金屬酶基因，檢測(cè)相應(yīng)的基因就需要設(shè)計(jì)不同的引物，且只能檢測(cè)已知耐藥基因，因此耗時(shí)長(zhǎng)。因此我們主要采用EDTA作為酶抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金屬酶檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，可能產(chǎn)其他型酶，有待檢測(cè)。

25株CRKP主要來(lái)自ICU和血液內(nèi)科，且標(biāo)本類(lèi)型主要為血液標(biāo)本。通過(guò)ERIC-PCR分型，25株肺炎克雷伯菌可分為8個(gè)亞型：Ⅰ型3株，Ⅱ型14株，Ⅲ型和Ⅶ型各2株，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ型各1株。該8個(gè)型別分布于多個(gè)科室，未呈現(xiàn)出集中于某個(gè)科室。

綜上所述，MHT試驗(yàn)、Carba NP試驗(yàn)和mCIM試驗(yàn)，對(duì)于碳青霉烯酶的篩查均快捷、簡(jiǎn)單、易行。此外，我院產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的基因型主要為KPC-2，其耐藥形式嚴(yán)重，而四環(huán)素類(lèi)藥物對(duì)其有良好的體外抗菌活性。因此臨床要加強(qiáng)防范，合理應(yīng)用抗生素治療該菌的感染及監(jiān)控耐藥株的傳播。