蛇床子素對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

張 炯，王 佳，王 芳，李貴森

腎臟缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是臨床上常見(jiàn)的一種臨床病理生理過(guò)程，是由于腎臟缺血及重獲血流灌注或氧供應(yīng)后, 對(duì)所產(chǎn)生的損傷作用。常繼發(fā)于腎移植、休克、心臟體外大循環(huán)手術(shù)等，是引發(fā)急性腎損傷乃至急性腎衰竭的常見(jiàn)原因[1-3]，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。如何減輕RIRI，成為改善腎功能的關(guān)鍵。蛇床子素(Osthole)是從天然植物蛇床中提取的一種單體，研究[4-5]顯示其具有抗病毒、抗氧化、抗炎、抗凋亡、增強(qiáng)免疫等多種生物學(xué)功能，并且毒副作用低，具有良好的臨床應(yīng)用前景。現(xiàn)就蛇床子素在腎臟缺血再灌注損傷中的作用及潛在機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1材料30只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Osthole購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度99．9%。Cleaved-Caspase3、Caspase3、Cleaved-Caspase9、Caspase9、Bax、BCL-2、Cyt C一抗均購(gòu)于美國(guó)CST公司；ATP活性試劑盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)試劑盒和線粒體膜電位試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Ebioscience公司；水合氯醛、聚乙二醇、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核提取試劑盒均購(gòu)于武漢谷歌公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與模型制備 30只SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組(Sham組)、腎臟缺血再灌注損傷組(RIRI組)和蛇床子素組 (Osthole組)。Osthole組在術(shù)前45 min分別給予腹腔注射藥物Osthole(40 mg /kg)，此劑量依據(jù)文獻(xiàn)[6]。Sham組和RIRI組在術(shù)前45 min給予腹腔注射等體積量的生理鹽水。參照Xie et al[6]建立大鼠RIRI模型。

1.2.2標(biāo)本收集 腎臟恢復(fù)血流再灌注24 h后,收集各組大鼠血清和左側(cè)腎臟, 離心，送四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐(creatinine, Cr)和血清尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)的水平，取部分左側(cè)腎置于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot蛋白檢測(cè)，其剩余腎組織置于10%的多聚甲醛以便利用HE染色觀察腎臟病理形態(tài)。

1.2.3HE染色組織學(xué)檢查 將多聚甲醛固定的腎臟組織行石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)變化，損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL)染色檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡，具體步驟參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.2.4Western blot檢測(cè)各組蛋白的表達(dá) 取-80 ℃冰箱保存的腎組織，按照試劑后說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和總蛋白。利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，然后上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育一抗[Cleaved-Caspase3抗體(1 ∶500)，Caspase3抗體(1 ∶1 000), Cleaved-Caspase9抗體(1 ∶500)，Caspase9抗體(1 ∶1 000), Bax抗體(1 ∶500), BCL-2抗體(1 ∶500)， CytC抗體(1 ∶500) 和β-actin抗體(1 ∶3 000)]，然后在4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。洗滌， 37 ℃孵育二抗(IgG)1 h，洗滌，利用ECL顯影劑顯影，Bio-Rad成像并分析灰度值，具體步驟參考說(shuō)明書(shū)和文獻(xiàn)[7]。

1.2.5線粒體的提取和線粒體膜電位測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取腎臟線粒體和檢測(cè)線粒體膜電位(ΔΨm),單位為毫伏(mv)，具體步驟參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.2.6腎臟活性氧(ROS)含量和ATP酶活性 提取腎組織勻漿按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)ROS含量和ATP酶活性。

2 結(jié)果

2.1蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎功能的影響與Sham組相比，RIRI組血清中Cr和BUN表達(dá)量明顯增加(P<0.05)；與RIRI組相比，Osthole組Cr和BUN表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，提示蛇床子素對(duì)腎臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，見(jiàn)表1。

表1 蛇床子素對(duì)Cr和BUN影響

與Sham組比較：***P<0.001；與Osthole組比較：#P<0.05

2.2蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟病理形態(tài)影響RIRI組與Sham組相比，腎小管明顯擴(kuò)張，管腔大量阻塞，腎小管大量壞死、脫落、大量蛋白管型、腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與RIRI組相比，Osthole組腎小管擴(kuò)張、管腔阻塞、壞死、脫落、腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯減少，具體損傷評(píng)分見(jiàn)圖1。提示蛇床子素可減少腎臟病理?yè)p傷。

2.3蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟線粒體膜電位的影響與Sham組相比， RIRI組線粒體膜電位(ΔΨm)明顯降低(P<0.05); 而Osthole組與RIRI組相比, 線粒體膜電位(ΔΨm)明顯增高(P<0.05)。提示蛇床子素可增加線粒體膜電位，見(jiàn)圖2。

圖1HE染色檢測(cè)蛇床子素對(duì)腎臟病理形態(tài)的影響×200

A：Sham組；B：RIRI組；C：Osthole組；與Sham組比較：***P<0.001；與RIRI組比較：#P<0.05

圖2 流式檢測(cè)蛇床子素對(duì)線粒體膜電位影響

與Sham組比較：***P<0.001；與RIRI組比較：#P<0.05

2.4蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟ROS含量影響與Sham組相比，RIRI組ROS含量明顯增高(P<0.05); 而Osthole組與RIRI組相比，ROS含量明顯降低(P<0.05)。提示蛇床子素可減少ROS含量，見(jiàn)圖3。

圖3 熒光分光光度法檢測(cè)蛇床子素對(duì)ROS含量的影響

與Sham組比較：**P<0.01；與RIRI組比較：#P<0.05

2.5蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟線粒體ATP酶活性影響與Sham組相比, RIRI組ATP酶活性明顯降低(P<0.05); 而Osthole組與RIRI組相比，ATP活性明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。提示蛇床子素可增加線粒體ATP酶活性。

2.6蛇床子素對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟凋亡信號(hào)通路的激活與Sham組相比， RIRI組Cleaved-Caspase9和 Cleaved-Caspase3表達(dá)均明顯增高(P<0.05)，而Caspase9和Caspase3表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。而Osthole組與RIRI組相比，Cleaved-Caspase9和 Cleaved-Caspase3表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，而Caspase9和Caspase3表達(dá)均明顯增高(P<0.05), 見(jiàn)圖5。提示蛇床子素可抑制凋亡信號(hào)通路的激活。

圖4 ATP酶法檢測(cè)蛇床子素對(duì)ATP活性的影響

與Sham組比較：*P<0.05；與RIRI組比較：#P<0.05

圖5 Western blot 檢測(cè)蛇床子素對(duì)Caspase9、Cleaved-Caspase9、Cleavaed-Caspase3和Caspase3 蛋白表達(dá)的影響

1：Sham組；2：RIRI組；3：Osthole組；與Sham組比較：***P<0.001；與RIRI組比較：#P<0.05

2.7蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響與Sham組相比，RIRI組BCL-2表達(dá)明顯降低 (P<0.05)，而B(niǎo)ax表達(dá)明顯增高(P<0.05)。而Osthole組與RIRI組相比，BCL-2表達(dá)明顯增高(P<0.05)，而B(niǎo)ax表達(dá)明顯降低(P<0.05), 見(jiàn)圖6。提示蛇床子素可減少凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。

2.8蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟細(xì)胞質(zhì)CytC表達(dá)影響與Sham組相比，RIRI組胞質(zhì)中CytC表達(dá)水平明顯增高(P<0.05); 而Osthole組與RIRI組相比，胞質(zhì)中CytC表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖7。提示蛇床子素可減少細(xì)胞質(zhì)CytC的表達(dá)。

1：Sham組；2：RIRI組；3：Osthole組；與Sham組比較：***P<0.001；與RIRI組比較：#P<0.05

2.9蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟凋亡細(xì)胞表達(dá)影響與Sham組相比，RIRI組TUNEL表達(dá)水平明顯增高(P<0.05); 而Osthole組與RIRI組相比，TUNEL表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖8。提示蛇床子素可減少細(xì)胞凋亡。

圖7 Western blot檢測(cè)蛇床子素對(duì)細(xì)胞質(zhì) CytC蛋白表達(dá)的影響

與Sham組比較：***P<0.001；與RIRI組比較：#P<0.05

3 討論

線粒體是胞內(nèi)能量合成和儲(chǔ)存的主要場(chǎng)所, 對(duì)缺血缺氧刺激特別敏感[ 8]。機(jī)體在正常生理狀況下, 通過(guò)線粒體代謝途徑消耗了90%以上的氧, 但其中2%的氧氣未能完全還原, 而是與呼吸鏈底物端逸出的電子結(jié)合生成超氧陰離子等ROS。因此線粒體是胞內(nèi)ROS生成的主要場(chǎng)所, 正常情況下,機(jī)體有完善的線粒體防御體系，體內(nèi)ROS處于生成和清除的動(dòng)態(tài)平衡中, 不損傷線粒體以及機(jī)體[8]。腎缺血時(shí)線粒體結(jié)構(gòu)被破壞，有氧氧化受阻, 線粒體ATP產(chǎn)生不足, 恢復(fù)血液再灌注時(shí)血超氧化物陰離子等明顯增強(qiáng)，導(dǎo)致ROS表達(dá)明顯增多，超過(guò)了機(jī)體ROS的清除能力，過(guò)量的ROS損害線粒體的抗氧化應(yīng)激以及自由基清除酶系統(tǒng), 導(dǎo)致自由基大量產(chǎn)生, 形成惡性的循環(huán)，導(dǎo)致過(guò)量的ROS蓄積[9]。而過(guò)量的ROS可攻擊線粒體，引起線粒體膜結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致抗凋亡蛋白BCL-2表達(dá)的降低和促凋亡蛋白Bax表達(dá)的增加以及Bax/BCL-2比率的上調(diào)。而B(niǎo)ax/BCL-2比值的上調(diào)可促進(jìn)Bax與維生素B8(腺嘌呤核苷酸)的轉(zhuǎn)位酶相結(jié)合，導(dǎo)致ΔΨm的減少和線粒體膜通道孔(MPTP)的大量開(kāi)放，進(jìn)而引起CytC等多種細(xì)胞蛋白從線粒體遷徙入胞質(zhì)。進(jìn)入胞質(zhì)的CytC與胞質(zhì)中的凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)結(jié)合可引起Caspase9的激活，而激活的Caspase9(Cleaved-Caspase9)可通過(guò)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)Caspase-3激活，激活的Caspase-3(Cleaved-Caspase3)可促進(jìn)下游的DNA 依賴性蛋白激酶裂解，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡[9-12]。在本研究中腎臟缺血45 min，再灌注24 h后Cr、BUN、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9、Bax、ROS、線粒體胞質(zhì)中AIF和CytC表達(dá)水平和腎組織病理改變以及TUNEL表達(dá)水平均明顯增加，而Caspase3、Caspase9和BCL-2的表達(dá)水平以及線粒體膜電位和ATP酶的活性均明顯減少。這與既往研究[9]結(jié)果相一致。

圖8TUNEL檢測(cè)蛇床子素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響×200

A：Sham組；B：RIRI組；C：Osthole組；與Sham組比較：***P<0.001；與RIRI組比較：#P<0.05

藥理學(xué)研究[5]發(fā)現(xiàn)蛇床子素可通過(guò)抑制線粒體途徑減輕腦缺血再灌注損傷并具有清除ROS的作用。本實(shí)驗(yàn)選用蛇床子素(40 mg/kg)對(duì)RIRI及線粒體凋亡信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示蛇床子素預(yù)處理可減輕血清Cr和BUN的表達(dá)，減少腎臟病理結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)一步證實(shí)了蛇床子素對(duì)RIRI有保護(hù)作用。對(duì)其與線粒體凋亡信號(hào)通路的關(guān)系深入研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素預(yù)處理可減少Cleaved-Caspase9、Cleaved-Caspase3、Bax、ROS、TUNEL以及線粒體胞質(zhì)中AIF和CytC的表達(dá)水平，但可明顯增加Caspase3、Caspase9和BCL-2的表達(dá)水平，線粒體膜電位和ATP酶的活性。其作用機(jī)制可能為蛇床子素可通過(guò)減輕線粒體腫脹和結(jié)構(gòu)的改變，促進(jìn)線粒體有氧氧化代謝途徑，增加ATP的生成和ROS的清除能力，從而減少Bax與維生素B8的結(jié)合，促進(jìn)ΔΨm的升高和抑制MPTP開(kāi)放，導(dǎo)致CytC遷徙和與AIF相結(jié)合的減少以及Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活受阻，進(jìn)而減少Caspase下游的DNA依賴性蛋白激酶的裂解，腎臟細(xì)胞凋亡乃至腎功能受損。

綜上所述，蛇床子素可通過(guò)減輕RIRI后ROS介導(dǎo)的線粒體結(jié)構(gòu)改變而減少線粒體內(nèi)CytC 的釋放，并抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活，減輕缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡，保護(hù)受損腎臟細(xì)胞，這可能是蛇床子素抗腎臟缺血再灌注腦損傷的機(jī)制之一。