二甲雙胍聯合索拉菲尼對肝癌HepG2細胞的協同抗腫瘤作用

劉國東，張 雪，林 群，方 強，單深良，謝 坤，劉付寶

肝細胞肝癌是肝臟腫瘤最常見的類型，其死亡率高，占腫瘤相關性死因的第三位[1]。全球每年有500 000例以上新診斷的患者，其中約50%來自中國[2]。盡管肝移植、手術切除和局部消融等治療方式改善了早期肝癌的預后，但肝癌的整體預后仍不理想，因為大多數患者診斷時已處于晚期階段。索拉菲尼(sorafenib，Sor)是FDA批準的晚期肝癌的標準治療藥物，但由于復發和轉移，藥物的反應率有所限制。二甲雙胍(metformin，Met)是2型糖尿病的常見治療藥物，它的抗腫瘤作用被廣泛研究，結果表明，Met可抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡以及增加化療和靶向藥物的敏感性[3]。該研究將探討Met與Sor聯合對肝癌細胞HepG2增殖及凋亡的影響，為肝癌的有效治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料肝癌細胞株HepG2由安徽醫科大學第一附屬醫院實驗室饋贈；Sor購于美國MCE生物公司；二甲雙胍、DMSO、MTT購于美國Sigma-Aldrich公司；DMEM培養基購自英國Hyclone 公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細胞凋亡試劑盒購于上海貝博生物公司；胎牛血清、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自北京碧云天生物公司；免疫印跡化學發光試劑ECL購自美國Millipore 公司；抗β-actin抗體、抗Erk抗體、抗p-Erk抗體、抗Akt抗體、抗p-Akt抗體購于美國CST公司；抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、HRP標記山羊抗小鼠和抗兔二抗購于北京中杉金橋生物技術公司。

1.2細胞培養將HepG2細胞株復蘇后培養于37 ℃、5% CO2的恒溫無菌培養箱中，使用的培養基為含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM。定期換液(1～2 d/次)，顯微鏡下觀察細胞形態，待細胞長至80%左右胰酶消化傳代，取對數生長期的細胞制備細胞懸液，用于實驗。

1.3MTT檢測Met及Sor對HepG2細胞增殖的影響實驗分為空白組、陰性對照組、藥物組。將HepG2細胞(密度1×105個/ml)均勻接種于96孔板中，細胞貼壁后作相應處理，Met組藥物濃度為1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L。Sor組藥物濃度為1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L，聯合組取上述各單藥組濃度組合。72 h后加入5 mg/ml的MTT液(20 μl/孔)，避光孵育4 h后棄上清液，加入DMSO(200 μl/孔)，震動10 min，于酶標儀上讀取490nm和655 nm雙波長處的吸光度(optical density，OD)值，計算增殖抑制率，抑制率(%)=[1- (實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。計算單藥的半數抑制濃度(IC50)及兩藥聯合時的聯合指數(combination index，CI)，CI<1表示兩種藥物有協同效應，CI=1表示兩種藥物有相加效應，CI>1表示兩種藥物有拮抗效應。后續各實驗取IC50作為單藥及聯合給藥的藥物濃度。實驗重復至少3次。

1.4熒光染色法觀察細胞凋亡形態學變化將細胞懸液均勻接種于6孔板中，待細胞貼壁生長至60%左右時，對照組細胞僅換液，實驗組包括Met組(10 mmol/L)、Sor組(6 μmol/L)、Met+Sor組(10 mmol/L+6 μmol/L)，藥物處理24 h后PBS洗滌2次，每孔依次加入Annexin V結合液500 μl、AnnexinV-FITC 5 μl,避光孵育10～15 min，再加入10 μl PI染液，避光孵育5 min，顯微鏡下觀察光鏡及熒光鏡下細胞凋亡形態學改變，拍照記錄。

1.5流式細胞術(flowcytometry，FCM)檢測細胞凋亡率實驗分組及處理同1.4項，藥物處理24 h后，胰酶消化收集細胞，冷PBS洗滌2次，按細胞凋亡試劑說明書進行FCM檢測，FlowJo7.6.1軟件分析各組細胞凋亡率。

1.6Westernblot檢測p-Erk、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達水平將上述4組細胞培養24 h后收集細胞，制備蛋白樣品，配膠上樣，SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠80 V，20 min；分離膠120 V，80 min)，轉膜(220 mA，100 min)，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗室溫孵育1 h或者4 ℃過夜，洗膜3次(10 min/次)，二抗室溫孵育1 h，洗膜3次(10 min/次)，加入ECL發光液，暗室中顯影、定影，烘干保存膠片。

2 結果

2.1Met、Sor及雙藥聯合對肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用MTT法結果顯示細胞的增殖抑制率隨著藥物濃度的升高而升高，Met和Sor單藥作用72 h的IC50分別為(9.87±1.52)mmol/L和(5.65±0.71)μmol/L(圖1)。計算各濃度單藥聯合時的CI值，結果均小于1，提示Met與Sor聯合具有協同作用，制作效應(Fa)-聯合指數(CI)圖(圖2)。

2.2熒光顯微鏡下觀察各組細胞的凋亡形態變化與對照組相比，Met與Sor處理組可見明顯處于早期凋亡的細胞(綠色熒光)；聯合組細胞凋亡更加顯著，細胞核或細胞質內可見增多的濃染的紅色熒光(晚期凋亡)，貼壁細胞數量大量減少，細胞間隙增大，細胞變瘦，呈現出明顯的凋亡特征(圖3)。

2.3FCM檢測各組細胞凋亡率各組細胞作用24 h后，Met、Sor及聯合組的細胞凋亡率分別為(13.94±0.40)%、(16.54±0.09)%、(42.09±1.12)%，與對照組相比，差異有統計學意義(F=1 536.00，P<0.01)(圖4)。

2.4Westernblot檢測相關蛋白表達水平與對照組相比，Met及Sor單藥均可一定程度地降低p-Erk蛋白、 p-Akt蛋白及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，增加促凋亡蛋白Bax的表達，兩藥聯合上述效應更顯著，差異有統計學意義(F=195.08、38.87、40.47、487.95，P<0.01)(圖5)。

圖1 MTT法檢測Met和Sor對HepG2細胞增殖的影響

圖2 Met和Sor對HepG2細胞的協同效應

圖3 熒光顯微鏡下觀察各組細胞凋亡的形態學變化 ×400

圖4 流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率

圖5 Western blot檢測p-Erk、p-Akt、Bcl-2、Bax等蛋白表達水平

3 討論

近年來，Met的潛在抗腫瘤作用被廣泛報道，包括肝細胞肝癌， 研究[4-6]表明，Met與化療或放療等方式聯合應用于多種腫瘤細胞中具有協同效應，在并且可能增強放療介導的肝細胞肝癌的凋亡作用、逆轉肝癌細胞的多藥耐藥性。Bhalla et al[7]的研究顯示，食用含有Met食物組的小鼠患肝癌的比例比對照組低57%，服藥后仍患腫瘤的小鼠其腫瘤平均體積比對照組小37%，說明Met對肝癌的預防和治療具有一定作用。

Met主要通過活化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)進而下調m-TOR信號通路發揮抑制腫瘤細胞生長的作用[8]。mTOR蛋白是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調節細胞生長、增殖、細胞周期等多個方面扮演著重要角色，mTOR的上游信號傳導途徑主要有兩條：① 經典的PI3K/Akt/mTOR信號通路。PI3K可被激活的Ras通路以及一些生長因子及細胞因子激活，進而激活Akt，活化的Akt可以直接磷酸化mTOR[9]。② 非依賴PI3K/Akt 途徑:越來越多的研究顯示AMPK與mTOR的活性調節有關。另外，Met可通過胰島素樣生長因子(insulin like growth factor,IGF)及其下游信號分子抑制腫瘤生長，Met可抑制腸道細胞吸收葡萄糖發揮降糖作用，有效降低胰島素水平，通過胰島素樣生長因子1(IGF-1)通路抑制腫瘤細胞增殖[10-11]。而PI3K/Akt/mTOR信號通路為胰島素樣生長因子受體(IGFR)下游一條重要信號通路，故Met也可通過抑制IGFR來抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而抑制mTOR信號通路。

該研究將Met與Sor聯合，結果顯示兩者均可抑制肝癌細胞的增殖、誘導細胞凋亡，兩藥聯合具有協同效應，熒光染色法觀察兩藥聯合后細胞凋亡形態學變化較單藥組更加明顯，Western blot檢測抗凋亡蛋白Bcl-2的表達減弱，促凋亡蛋白Bax表達增強，進一步探究發現Met及Sor單藥均可降低p-Erk和p-Akt的表達，聯合應用上述效果更顯著。Met可通過減少肝糖原異生，增加周圍組織對胰島素的敏感性、抑制腸道細胞吸收葡萄糖發揮降糖作用，有效降低胰島素水平，通過抑制IGFR信號通路進而抑制p-Akt，使細胞增殖受到抑制，發生凋亡，并且Met還可抑制線粒體氧化呼吸鏈復合體Ⅰ的功能，使ATP合成減少，AMP水平升高，間接激活AMPK[12]。Sor是一個多靶點的小分子激酶抑制劑，它可以通過抑制Raf激酶、血管內皮生長因子受體(VEGFR) 和血小板衍生生長因子(PDGF)等多個途徑發揮抗腫瘤作用[13]。該研究發現Sor可直接抑制Raf/MEK/ERK信號通路，降低p-Erk的表達，并且其可能通過抑制Ras/Raf的活性繼而抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路。

本研究結果證實Met和Sor聯合可共同抑制PI3K/Akt/mTOR和Raf/MEK/ERK信號通路，發揮協同抗腫瘤作用，為肝癌新的治療方式提供理論依據，然而，藥物的抗腫瘤機制十分復雜，是否有其他機制參與其中尚需進一步研究。