多肽pPRDX5tide對心肌低氧損傷保護作用的研究

余學釗，汪 洋，葉 琦，陶 瑜

缺血性心臟病是由于冠狀動脈循環改變引起冠狀動脈血流和心肌需求之間不平衡而導致的心肌損害，其中最常見的原因為冠狀動脈粥樣硬化引起的冠狀動脈狹窄和閉塞，約占缺血性心臟病的90%左右。冠心病多發生于40歲以上，其患病率及病死率均隨年齡而上升[1];我國人口基數大，正面臨人口老齡化的嚴峻形勢，近年來冠心病的發病人數逐年增多,給社會經濟和公共衛生系統都帶來了極大負擔[2]。

多肽是指含少量氨基酸的小分子蛋白，近年來的研究已表明多肽在多種生理和病理過程中發揮著重要作用，但多肽在缺血性心臟病中的研究尚少[3-4]。之前的研究對低氧培養的新生大鼠心肌細胞與常氧培養的新生大鼠心肌細胞進行串聯質譜標記法(TMT)檢測，篩選出一批顯著差異表達的多肽[5]。通過生物信息學對其功能聚類分析，從中挑選出表達明顯上調的多肽pPRDX5tide作為研究對象，探討其在缺血性心臟病中的可能作用。以大鼠心肌細胞H9c2為研究對象，通過兩種低氧應激模型：① 低氧袋誘導的無氧環境；② 在培養上清液中加入CoCl2誘導細胞低氧損傷[6-7]。分別檢測心肌損傷相關指標，評估多肽對心肌低氧的保護作用。該研究擬檢測pPRDX5tide在H9c2細胞不同低氧損傷模型中的作用，探究其在缺血性心臟病中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 DMEM(批號：8117278)、無糖DMEM(批號：8117165)、PBS(批號：311010035)、trypsin胰酶(批號：1760553)、胎牛血清(FBS,批號：AC10248326)、P/S青霉素/鏈霉素(批號：1864874)購自美國Gibco公司；AnaeroPack(批號：7097ZJ-3)購自日本Mitsubishi Gas Chemical公司；CoCl2(批號：2016.04.29 )購自天津科密歐公司；乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒(批號：C0017-5)、臺盼藍染色試劑盒(批號：S0033)、活性氧檢測試劑盒(批號：S0033)購自廣東碧云天生物技術有限公司；Caspase3抗體(批號：360758)、PARP抗體(批號：GR119170-6)、β-actin抗體(批號：110603)購自美國Abcam公司；實驗所用H9c2細胞株購自美國菌種保藏中心ATCC。

1.1.2多肽 多肽序列：DSLVSLF；穿膜序列：RKKRR-QRRR-A；pPRDX5tide：RKKRRQRRR-A-DS-LVSL由上海科肽生物技術有限公司合成。

1.2方法

1.2.1H9c2細胞培養 H9c2細胞為大鼠心肌細胞，用含有10% FBS和1% P/S的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2的條件下培養。

1.2.2細胞低氧 物理低氧：以六孔板接種細胞，待密度達到70%～80%后，低氧組換成無糖無血清的DMEM培養基，對照組換成DMEM完全培養基，分別以不同濃度(10、20、50 μmol/L)pPRDX5tide預處理H9c2細胞，2 h后，低氧組置于低氧箱中按條件進行低氧10 h。

化學低氧：以6孔板接種細胞，待密度達到70%～80%后，在正常培養基中按條件加入不同濃度(10、20、50 μmol/L)的pPRDX5tide預處理H9c2細胞，2 h后，低氧組加入模擬物CoCl2使終濃度為700 μmol/L進行24 h化學低氧。

1.2.3乳酸脫氫酶的活性檢測 吸取細胞培養基，8 000 r/min離心5 min，96孔板每孔加入樣品120 μl和工作液60 μl,室溫孵育30 min后，酶標儀檢測490 nm下的吸光度。

1.2.4臺盼藍染色 收集所有的H9c2細胞，按照臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒步驟進行染色，染色后用血細胞計數板計數，細胞死亡率=藍色細胞數/細胞總數×100%。

1.2.5細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的檢測 低氧結束后去除細胞培養液，加入適當體積的用無血清DMEM 1 ∶1 000稀釋的DCFH-DA,37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，無血清DMEM洗滌細胞3次，直接在熒光顯微鏡下觀察并對各組隨機選取區域進行拍攝。

1.2.6Western blot 用細胞刮刮取細胞后，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，取適量RIPA裂解蛋白，收取裂解液，制樣后進行蛋白質免疫分析。

2 結果

2.1生物信息學分析對前期的多肽組學結果中差異較大的前體蛋白(P<0.05,變化倍數>2)進行基因本體(gene ontology, GO)分析(圖1A)，結果顯示，較多基因聚類于細胞凋亡的負性調控、細胞與細胞的黏附、mRNA的加工與處理。其中，凋亡過程(apoptotic process)有較高的富集，已知凋亡在心肌細胞早期損傷中扮演著重要角色，再對其中聚類的蛋白進一步進行熱圖分析(圖1B)，從中挑選出差異顯著的 pPRDX5tide作進一步生物信息學分析，發現pPRDX5tide(共7個氨基酸序列)，前體蛋白為過氧化物酶5(peroxiredoxin 5, PRDX5) (213個氨基酸序列)，pPRDX5tide位于前體蛋白序列中的第166～172個氨基酸位點處，參與凋亡過程的調節，在小鼠和人中均具有較高的保守性(圖1C)。

圖1 多肽組數據分析及pPRDX5tide的生物信息學分析

圖2 pPRDX5tide保護物理低氧造成的損傷

A:物理低氧造模；與對照組比較：***P<0.001；B：物理低氧模型下，pPRDX5tide對LDH釋放的作用；與低氧組比較：##P<0.01,###P<0.001

2.2pPRDX5tide降低乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)的活性通過應用乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒，檢測細胞的損傷作用。結果顯示：采用低氧袋處理10 h和700 μmol/L CoCl2處理24 h分別進行物理和化學低氧造模的方法,檢測LDH釋放量(OD490 nm)，物理低氧(1.667±0.031)較正常對照組(1.017±0.021)以及化學低氧(加入400、700 μmol/L CoCl2的LDH釋放量分別為：1.481±0.030、1.924±0.28)較正常對照組(1.028±0.021)差異均有統計學意義，可見均可對H9c2細胞造成損傷(圖2A、3C)。加入不同濃度的pPRDX5tide(10、20、50 μmol/L)可呈濃度依賴性地抑制細胞中LDH的釋放(分別為1.486±0.043、1.333±0.039、1.322±0.027)(圖2B、3D)，且在50 μmol/L濃度時的作用最為明顯。綜上所述，pPRDX5tide可降低LDH的活性水平及釋放，對細胞起到保護作用。

2.3pPRDX5tide提高細胞的存活率應用臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒進行細胞存活率的檢測。結果顯示：低氧后，細胞的死亡率明顯增加(0.415±0.019)，常氧情況下，細胞死亡率為(0.074±0.009)，加入pPRDX5tide后并不影響細胞的存活率，死亡率為(0.095±0.012)，對細胞不產生毒性作用，而在低氧時，pPRDX5tide能明顯降低細胞的死亡率(0.204±0.023)(圖3A、3E)。所以，pPRDX5tide能提高細胞的存活率，對細胞起到保護作用。

2.4pPRDX5tide降低ROS水平應用雙氯熒光素(DCFH-DA)染色法檢測細胞內ROS水平。結果顯示：常氧情況下，pPRDX5tide對ROS水平無影響，熒光強度基本不變,見圖3D(c)、3F(c)；低氧時，細胞內產生大量的活性氧物質，熒光強度明顯增加,見圖3D(b)、3F(b)。濃度為50 μmol/L pPRDX5tide能明顯抑制低氧時產生的大量ROS，使得熒光強度較低氧時明顯降低，該濃度時熒光強度降低也最為明顯[圖3D(d)、3F(d)]，pPRDX5tide能抑制低氧對ROS水平的促進作用。

2.5pPRDX5tide降低凋亡蛋白的水平Caspase3和PARP活化時能產生切割帶，表明凋亡的激活，pPRDX5tide呈劑量依賴性的抑制凋亡蛋白Caspase3和PARP的活化，濃度越大,凋亡蛋白活化的表達水平越低，50 μmol/L時作用最為明顯，切割帶的表達水平最低，即50 μmol/L pPRDX5tide抑制凋亡的效果最佳(圖4A)。這表明，pPRDX5tide參與細胞凋亡過程的調節，具有抗凋亡作用，能降低低氧造成的心肌細胞的凋亡。

3 討論

pPRDX5tide是從低氧新生大鼠心肌細胞中選擇的表達上調的多肽。對新生大鼠低氧心肌細胞與未低氧心肌細胞進行檢測顯示：pPRDX5tide在低氧心肌細胞中顯著增高，利用H9c2細胞的物理與化學低氧模型進行研究，結果顯示pPRDX5tide能抑制H9c2細胞的凋亡，降低低氧狀態下H9c2細胞的死亡率，上述結果表明pPRDX5tide對心肌低氧損傷有一定的保護作用。

作為細胞功能的重要調節分子，細胞內源性多肽已受到越來越多的關注。一般認為，多肽作為其前體蛋白的水解產物，常保留其一部分空間結構及作用位點，在生物功能上能夠通過激活、拮抗其前體蛋白的作用靶點發揮與前體蛋白相似或相反的生物功能[8]。在研究中，通過生物信息學分析表明pPRDX5tide定位于 PRDX5的第166個至172個氨基酸，全長7個氨基酸，研究[9-10]顯示PRDX5參與細胞凋亡、氧化應激等多種生物過程。目前已有研究[11]顯示PRDX5可通過一系列的氧化還原反應保護線粒體DNA免受氧化應激的損傷、抑制p53介導的細胞凋亡。pPRDX5tide是否通過影響PRDX5的靶點功能來抑制細胞凋亡，保護細胞免受低氧損傷，需進一步檢測PRDX5的下游信號活性變化以及p53信號通路的激活情況，并通過挽救策略，深入論證其具體的作用機制。

圖3 pPRDX5tide保護不同模式的低氧損傷并抑制ROS的產生

A：物理低氧模型下，pPRDX5tide對細胞死亡率的影響；與低氧組比較：**P<0.01；B：化學低氧造模合適條件；與0 μmol/L組比較：##P<0.01,###P<0.001；C：化學低氧模型下，pPRDX5tide對細胞死亡率的影響；與低氧組比較：▽P<0.05；D:物理低氧模型下，pPRDX5tide對活性氧的作用(×200；a：正常培養條件；b：物理低氧條件下；c：常氧下，pPRDX5tide預處理；d：物理低氧條件下，pPRDX5tide預處理)； E：化學低氧模型下，pPRDX5tide對乳酸脫氫酶釋放的作用；與低氧組比較：△△△P<0.001；F：化學低氧模型下，pPRDX5tide對活性氧的作用(×200；a：正常培養條件；b：化學低氧條件下；c：常氧下，pPRDX5tide預處理；d：化學低氧條件下，pPRDX5tide預處理)

本文研究了pPRDX5tide對H9c2細胞低氧損傷的保護作用，論述了pPRDX5tide與缺血性心臟病之間的相關性。研究結果可能為探究缺血性心臟病的發生發展機制提供新思路，為缺血性心臟病的防治提供新的分子靶點。

圖4 pPRDX5tide抑制氧化損傷中凋亡關鍵蛋白的活化