樺褐孔菌乙酸乙酯部位化學成分及體外抗腫瘤活性研究

吳澤華，程文明,2，張致勇，繆憶如，李春如

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)又名白樺茸，是銹革孔菌科、褐臥孔菌屬的藥用真菌。主要分布在俄羅斯(西西伯利亞、堪察加半島)、北美、波蘭、芬蘭、日本(北海道)以及中國吉林省(長白山)、黑龍江、內蒙古(大興安嶺)。在民間擁有廣泛的應用基礎，用于治療多種癌癥(肝癌、胃癌、腸癌等)、糖尿病、心臟病,并且能抑制病毒等。相關文獻[1]資料顯示，該菌還有多種活性成分，主要含有多種三萜和甾醇類化合物。近代藥理學研究表明樺褐孔菌乙酸乙酯萃取物具有較強抗腫瘤活性。為了明確樺褐孔菌藥效的物質基礎，對其進行提取分離，并將得到的單體化合物進行初步的抗腫瘤活性篩選，為更進一步開發樺褐孔菌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1藥材與瘤株樺褐孔菌產于吉林省撫松縣，經浙江泛亞生命科學研究院李春如教授鑒定，存放于安徽醫科大學藥學院天然藥物化學實驗室。人胃癌SGC-7901、肝癌HepG2及神經膠質瘤U-87細胞由安徽醫科大學藥學院提供。

1.2儀器與試劑AVANCE 500型超導核磁共振光譜儀(瑞士Bruker公司，內標為四甲基硅烷)；LC-8A制備液相色譜儀(日本島津公司)； 6210 TOF LC-MS 液質聯用儀(美國Agilent公司)；2306-Z CO2培養箱(美國)；uQuant全波長酶標儀(美國Biotek公司)。HPD100大孔樹脂(河北寶恩公司)；薄層色譜GF254 硅膠板(煙臺江友硅膠開發有限公司)；柱層析硅膠(青島海洋化工廠)；小孔樹脂MCI(日本Mitsubishi Chemical公司)；SephadexLH-20 (瑞典GEHealthcare Bio-Sciences公司)；氘代試劑(美國Sigma公司)；甲醇、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇(西隴化工股份有限公司，為分析純)；DMEM培養基(美國Hyclone)；胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所)；胰酶(上海碧云天生物技術研究所)；PBS(武漢博士德生物科技有限公司)；DMSO、MTT(美國Sigma公司)；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)(上海漢博生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1分離提取 將8 kg樺褐孔菌干粉用10倍量95%乙醇，60 ℃提取4遍，每次12 h，過濾，合并藥液并減壓濃縮(溫度不超過60 ℃) 藥膏至沒有醇味，得到浸膏。加適量水使其混懸，分別用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，依次濃縮回收萃取液，得乙酸乙酯萃取物(FA)180 g。對乙酸乙酯部位(FB)(160 g)進行硅膠柱層析，以氯仿-甲醇50 ∶1、30 ∶1、15 ∶1、5 ∶1、1 ∶1梯度洗脫，通過薄層色譜(TLC)跟蹤合并相同流份，得到9個部分A1～A9。A2經MCI(甲醇-水1 ∶9～10 ∶0)，得A2-1～A2-8，A2-2經反復硅膠柱色譜(氯仿-甲醇50 ∶1)得3個部分(A2-2-1～A2-2-3)，A2-2-2經制備液相(甲醇-水1 ∶4～1 ∶1)純化得化合物1(54 mg)。A2-3經SephadexLH-20凝膠柱(甲醇-水1 ∶4～甲醇)、硅膠柱(氯仿-甲醇15 ∶1)得到化合物2(25 mg)。A2-7經SephadexLH-20凝膠柱(甲醇-水1 ∶4～10 ∶0)、制備液相(甲醇-水3 ∶7～1 ∶1)純化得到化合物3(21 mg)。A1經MCI(甲醇-水1 ∶9～10 ∶0)，得A1-1～A1-13。A-11經SephadexLH-20凝膠柱(甲醇-水1 ∶4～10 ∶0)、硅膠柱(氯仿-甲醇25 ∶1)得到化合物4(13 mg)。A1-3經SephadexLH-20凝膠柱(甲醇-水1 ∶4～10 ∶0)、制備液相(甲醇-水2 ∶3～7 ∶3)純化得到化合物5(3.7 mg)。A1-6經硅膠柱(氯仿-甲醇50 ∶1，石油醚-丙酮15 ∶1)得到化合物6(21 mg)。A1-10經MCI(甲醇洗脫)、硅膠柱(石油醚-丙酮50 ∶1)得到4個部分(A1-10-1～A1-10-4)，A1-10-1經硅膠柱(石油醚-丙酮80 ∶1)SephadexLH-20凝膠柱(甲醇-水1 ∶4～10 ∶0)得到化合物7(10.5 mg)。A1-10-3經制備液相(甲醇-水2 ∶3～7 ∶3)純化得化合物8(12 mg)。A5經MCI(甲醇-水1 ∶9～10 ∶0)得5個部分(A5-1～A5-5)。A5-5經SephadexLH-20凝膠柱(甲醇-水1 ∶4～10 ∶0)得5個部分(A5-5-1～A5-5-5)，A5-5-3經硅膠柱(氯仿-甲醇20 ∶1)、制備液相(甲醇-水1 ∶1～2 ∶1)純化得化合物9(4.5 mg)、化合物10(10.5 mg)。A1-6經硅膠柱(氯仿-甲醇20 ∶1洗脫)、SephadexLH-20凝膠柱(甲醇-水1 ∶4～10 ∶0)、制備液相(甲醇-水1 ∶1～4 ∶1)純化得到化合物11(3.4 mg)、化合物12(4.5 mg)。

1.3.2結構鑒定 分析所得化合物的核磁共振碳譜(nuclear magnetic resonance carbon spectrum，13C-NMR)、核磁共振氫譜(nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum，1H-NMR)和高分辨率質譜(high resolution mass spectrometer，HRMS)數據，與文獻比對確定化合物結構。

1.3.3抗腫瘤活性單體化合物篩選 三種細胞用含10%熱滅活的胎牛血清DMEM高糖培養基，于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養。設空白對照組、化合物不同濃度組(200、100、50、25、12.5 μmol/L)及陽性藥物組(5-FU，200、100、50、25、12.5 μmol/L)。取對數生長期細胞(5 000個/孔)接種于96孔板中，細胞貼壁后按上述分組加入相應化合物，每個濃度5個復孔，空白對照組加入相同體積培養基。細胞培養48 h后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，培養4 h后棄去上清液，每孔加入150 μl的DMSO，振蕩10 min后用酶標儀(492 nm)檢測吸光度。實驗重復3次。

2 結果

2.1結構鑒定

2.1.1化合物1 灰白色粉末，熔點(melting point，mp)153～154 ℃, HRMS質荷比(m/z)137.02 [M-H]-。1HNMR (CD3OD): 7.09 (d, J=1.8 Hz, H-2), 6.80 (d, J=7.6 Hz, H-5), 9.57 (s, -CHO);13C-NMR (CD3OD): 130.8 (C-1), 115.3 (C-2), 147.1 (C-3), 153.7 (C-4), 116.2 (C-5), 126.4 (C-6), 193.1 (C-7)。以上數據與文獻[2]相關數據對照基本一致，故確定化合物1為原兒茶醛。

2.1.2化合物2 橘黃色粉末，mp.177～179 ℃。HRMS m/z: 201.05 [M+Na]+。1HNMR (CD3OD): 2.32 (3H, s, H-1), 6.53 (1H, d, J=16.2 Hz, H-3), 7.51 (1H, d, J=16.2 Hz, H-4), 7.00 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 6.77 (1H, d, J=8.1 Hz, H-9) , 6.97 (1H, dd, J= 8.1, 2.1 Hz, H-10);13C-NMR (CD3OD): 27.5 (C-l), 201.6 (C-2), 123.5(C-3), 146.9 (C-4), 127.6 (C-5), 116.0 (C-6), 147.3 (C-7), 150.4 (C-8), 117.1 (C-9), 124.6 (C-10)。以上數據與文獻[3]相關數據對照基本一致，故確定化合物2的結構為4-(3，4-二羥苯基)-3-丁烯-2-酮。

2.1.3化合物3 黃色片狀結晶(乙醇)，mp.196～197 ℃。HRMS m/z: 252.04 [M-H]-。 1HNMR (CDCl3): 12.15(1H, s, 8-OH), 12.04(1H, s, 1-OH), 7.05(1H, s, H-2), 7.26(1H, dd, J=8.0, 2.0 Hz, H-7), 7.60(1H, s, H-4), 7.64(1H, t, J=8.0 Hz, H-6), 7.76(1H,t, J=8.0, 2.0 Hz, H-5), 2.45(3H, s, CH3);13C-NMR (CDCl3):162.7 (C-1), 124.3 (C-2), 132.9 (C-3), 124.0 (C-4), 113.6 (C-5), 149.1 (C-6), 115.8 (C-7), 162.4 (C-8), 192.5 (C-9), 182.0 (C-10), 133.2 (C-4a), 119.2 (C-8a), 120.4 (C-9a), 137.2 (C-10a)。分子質量為254，推測其分子式為C15H10O4。在1HNMR中，12.15、12.04為醌環上的兩個羥基信號，2.45為醌環上甲基信號，7.05-7.76為醌環上氫信號。13C-NMR中192.5、182.0為9、10號碳的信號峰，與文獻[4]對照，確定為大黃酚。

2.1.4化合物4 白色粉末，mp.134～135 ℃。HRMS m/z: 684.84 [M]+。1HNMR (CD3OD): 5.10 (1H, br, t, J=8.9 Hz, H-2′), 3.90 (2H, overlapped, H-3, H-4), 3.82 (1H, m, H-5), 3.60 (1H, dd, J=8.9 Hz, H-1B), 3.52 (1H, dd, J=8.9 Hz, H-1A) , 3.30 (1H, m, H-2), 1.24 (br.s, CH2-chain), 0.69 (6H, t, H-18, H-24′);13C-NMR (CD3OD): 175.2 (C-1′), 130.0 (C-2′), 73.5 (C-4), 71.2 (C-3), 69.6 (C-5), 60.2 (C-1), 50.2 (C-2), 31.7 (C-6), 30.2, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 29.0 (C-chain), 27.6, 26.5, 25.6, 22.7, (C-17), 14.0 (C-18)。以上數據與文獻[5]對照基本一致，故確定化合物4為Coelarthenol。

2.1.5化合物5 無色油狀物，易溶于氯仿、甲醇等有機試劑。HRMS m/z : 301.14 [M+Na]+。1HNMR (CD3OD): 7.72 (2 H, dd, J=6.0, 3.3 Hz, H-3, H6), 7.60 (2 H, dd, J=6.0, 3.3 Hz, H-4, H-5), 4.27 (4 H, t, J=6.6 Hz, H-8, H-8′), 1.71 (4 H, m, H-9, H-9′), 1.42 (4 H, m, H-10, H-10′), 0.97 (6 H, t, J=7.1 Hz, H-11, H-11′-CH3);13C-NMR (CD3OD): 133.5 (C-1), 133.5 (C-2), 130.0 (C-3), 132.3 (C-4), 132.3 (C-5), 129.8 (C-6), 169.4 (C-7, 7′), 66.7 (C-8, 8′), 31.7 (C-9, 9′), 20.2 (C-10, 10′), 14.0 (C-11, 11′)。以上數據與文獻[6]報道一致，故鑒定化合物5為鄰苯二酸二正丁基酯(1，2-benzenedi-carboxylic acid dibuty ester)。

2.1.6化合物6 白色針狀晶體，mp.258～260 ℃。HRMS m/z : 455.35 [M-H]-。HNMR (CD3OD) δ: 0.65 (3H, s, H-18), 0.71 (3H，s:H-19), 0.82 (3H, s, H-28) ，0.91 (3H, s, H-30), 0.92 (3H, s, 3H) 為5個高場區的角甲基尖峰，這為四環三萜類化合物的典型結構特征，1.52 (3H, brs, H-26), 1.64 (3H, brs, H-27) 是兩個烯丙位的甲基峰，3.02 (1H, m, J=10.0, 5.1, 5.0 Hz, H-3), 4.34 (1H, d, J=5.1Hz, 3-OH), 5.05 (1H，t，J=7.0 Hz, H-24), 12.05 (1H, s, COOH)。13C-NMR (CD3OD): 177.0 (C-21), 134.2 (C-8), 133.3 (C-9), 131.1 (C-25), 123.8 (C-24), 76.7 (C-3), 49.9 (C-5), 48.9 (C-14), 47.4 (C-17), 46.5 (C-20), 43.7 (C-13), 38.5 (C-4), 36.5 (C-10), 35.1 (C-1), 32.2 (C-15), 29.9 (C-16), 28.3 (C-2), 28.0 (C-7), 27.5 (C-29), 26.4 (C-22), 25.9 (C-12), 25.5 (C-23), 25.4 (C-26), 24.0 (C-30), 20.2 (C-11), 18.9 (C-6), 17.8 (C-19), 17.4 (C-27), 15.8 (C-18), 15.60 (C-28)。以上數據與文獻[7]對照基本一致，故確定化合物6為栓菌酸。

2.1.7化合物7 無色油狀液體，有果香，mp.55 ℃。1HNMR (CD3OD): 1.32 (3H, t, J=7.2 Hz, H-3″), 1.78 (6H, t, J=7.2 Hz, H-7, 7′), 2.76 (2H, d, J=15.2 Hz, H-3), 2.94 (2H, d, J=15.2 Hz, H-3′), 4.10 (4H, q, J=7.2 Hz, H-6, 6′), 4.21 (2H, q, J=7.2 Hz, H-2″), 4.93 (1H, -OH);13C-NMR (CD3OD): 13.1 (C-7, 7′), 13.2 (C-3′′), 43.2 (C-3, 3′), 60.4 (C-6, 6′), 61.5 (C-2″), 73.2 (C-2), 170.0 (C-1), 173.2 (C-4, 4′)。以上數據與文獻[8]對照一致，由此確定化合物7為檸檬酸三乙酯。

2.1.8化合物8 無色細針狀結晶，mp.228～230 ℃。HRMS m/z: 429.29[M-H]-。1HNMR (CD3OD): 0.61 (s,3H), 0.81 (d, 3H, J=7.0 Hz), 0.81 (d, 3H, J=7.0 Hz), 0.88 (d, 3H, J=7.0 Hz), 0.97 (d, 3H, J=6.5 Hz), 1.01 (s, 3H), 1.97 (m,1H), 3.50 (m, 1H, H-6T), 3.92 (m, 1H, H-3T), 5.14 (dd, 1H, J=10.0, 2.0 Hz), 5.17 (dd, 1H, J=10.0, 2.0 Hz), 5.22 (m, 1H);13C-NMR (CD3OD): 143.7 (C-8), 137.2 (C-22), 133.3 (C-23), 119.1 (C-7), 77.1 (C-5), 74.2 (C-6), 68.4 (C-3), 57.4 (C-17), 55.9 (C-14), 44.7 (C-9), 44.6 (C-24), 44.2 (C-4), 41.7 (C-20), 40.5 (C-12), 40.4 (C-20), 38.2 (C-10), 34.7 (C-2), 33.9 (C-25), 31.6 (C-1), 30.7 (C-16), 24.1 (C-15), 23.5 (C-11), 21.7 (C-26), 20.6 (C-21), 20.4 (C-27), 18.9 (C-19), 18.6 (C-28), 12.5 (C-18)。以上數據與文獻[9]對照基本一致，故確定化合物8為(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇。

2.1.9化合物9 無定形粉末。HRMS m/z: 295.08 [M-H]-。1HNMR (CD3OD): 7.31 (1H, s), 4.58 (1H, overlapped) , 4.21(H, dd, 6.3, 7.7 Hz), 3.84 (6H, s), 3.82 (1H, dd, J=3.5, 11.0 Hz), 3.60 (1H, dd, J=3.5, 11.0 Hz), 3.00 (1H, m);13C-NMR (CD3OD): 125.8 (C-1), 106.6 (C-2), 147.7 (C-3), 141.8 (C-4), 147.8 (C-5), 106.6 (C-6), 195.7 (C-7), 43.6 (C-8), 68.0 (C-9), 176.5 (C-10), 45.7 (C-11), 58.9 (C-12), 56.2 (-OCH3)。以上數據與文獻[10]報道一致，故鑒定化合物9為白木香素A(AquilarinA)。

2.1.10化合物10 無色油狀物，易溶于氯仿、丙酮，難溶于甲醇。HRMS m/z: 301.14 [M+Na]+。1HNMR (CDCl3): 0.95 (3H, overlapped, H-4″), 0.94 (3H, overlapped, H-4′), 0.98 (3H, overlapped, H-3″), 1.46 (2H, m, H-3′), 1.72 (2H, m, H-2′), 2.05 (1H, m, H-2″), 4.09 (2H, d, J=8.0 Hz, H-1″), 4.32 (2H, m, H-1′), 7.52 (2H, m, H-3, 5), 7.72 (2H, m, H-2, 6);13C-NMR (CDCl3): 132.2 (C-1), 130.8 (C-2, 6), 128.8 (C-3, 5), 132.1 (C-4), 167.7 (C-7, 7′), 65.6 (C-1′), 30.5 (C-2′), 19.2 (C-3′), 13.7 (C-4′), 71.8 (C-1″), 27.7 (C-2″), 19.1 (C-3″, 4″)。通過波譜數據分析并與文獻[11]比較，鑒定化合物10為 1， 4-benzenedicarboxylic acid 1-butyl-4- (2-methylpropyl) ester。

2.1.11化合物11 無色針晶(甲醇)，mp.142～146 ℃，HRMS m/z: 437.19 [M+K]+。1HNMR (CDCl3): 0.56 (3H, s, H-8), 0.91 (3H, d, H-7), 0.93 (3H, d, H-6), 0.95 (3H, d, H-1), 1.02 (3H, d, H-8), 1.30 (3H, s, H-9), 3.52 (1H, m, H3), 5.34 (1H, d, H-7), 5.41 (2H, m, H-2, H-23);13C-NMR (CDCl3): 37.2 (C-1), 31.5 (C-2), 71.8 (C-3), 38.0 (C-4), 40.2 (C-5), 29.5 (C-6), 117.4 (C-7), 139.4 (C-8), 34.5 (C-9, C-10), 21.4 (C-11), 39.3 (C-12), 43.5 (C-13), 55.1 (C-14), 23.2 (C-15), 27.9 (C-16), 55.9 (C-17), 11.6 (C-18), 13.0 (C-19), 40.6 (C-20), 21.3 (C-21), 132.3 (C-22), 135.7 (C-23), 39.6 (C-24), 33.2 (C-25), 19.7 (C-26), 20.3 (C-27), 18.2 (C-28)。以上數據與文獻[12]對照基本一致，故確定化合物11為3β-羥基-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯。

2.1.12化合物12 白色粉末，mp.168～169 ℃。HRMS m/z: 684.64[M]+。1HNMR (CDCl3): 0.54 (3H, s, H-18), 0.77 (3H, d, H-28), 0.79 (3H, d, H-26), 0.80 (3H, s, H-19), 0.84 (3H, d, H-27), 0.90 (3H, d, H-21), 3.62 (1H, m, H-3), 5.14 (1H, m, H-7);13C-NMR (CDCl3): 139.4 (C-8), 117.4 (C-7), 71.0 (C-3), 56.0 (C-17), 55.0 (C-14), 49.4 (C-4), 43.2 (C-13), 40.2 (C-5), 39.5 (C-12), 39.1 (C-24), 38.3 (C-4), 37.4 (C-1), 36.6 (C-20), 34.2 (C-10), 33.5 (C-22), 31.5 (C-2), 31.4 (C-25), 30.5 (C-23), 29.6 (C-6), 27.9 (C-16), 22.5 (C-15), 21.5 (C-11), 20.5 (C-26), 19.5 (C-21), 17.6 (C-27), 15.5 (C-28), 13.0 (C-19), 11.8 (C-18)。以上數據與文獻[13]對照基本一致，故確定化合物12為(24S)-Ergost-7-en-3β-ol。

2.2抗腫瘤活性測試MTT法測分離得到的單體化合物對腫瘤細胞增殖能力的影響，結果表明化合物2、6、8有較強的抑制腫瘤細胞增殖的作用，且呈現濃度依賴關系，其IC50值如表1所示。

表1 部分單體化合物對腫瘤細胞抑制效應的IC50值

3 討論

從天然產物尤其是真菌中篩選抗腫瘤活性物質是研發抗腫瘤新藥的一個重要方向。查閱相關文獻及國內外諸多研究結果顯示，樺褐孔菌提取物具有較強抗腫瘤活性，主要通過抗有絲分裂及抑制蛋白質的生物合成影響腫瘤細胞的增殖，誘導細胞凋亡。也有部分研究者認為其多糖類物質可以激活機體免疫系統從而發揮抗腫瘤作用。目前對樺褐孔菌中發揮抗腫瘤活性的單體研究較少，且與其活性相關的質控成分尚不完整，需進一步完善。

課題組前期對樺褐孔菌各部位提取物進行了活性篩選，發現石油醚萃取物以及乙酸乙酯萃取物具有明顯的體內外抗腫瘤活性，但對其化學成分以及發揮效應的成分尚不明確。本文在課題組前期試驗基礎上，采用多種分離純化手段，從樺褐孔菌乙酸乙酯萃取物中分離純化出12個已知單體化合物，查閱文獻顯示，其中化合物2和化合物9為首次從該菌中分離得到。對部分化合物進行了體外抗腫瘤活性研究，化合物2、6、8具有較強抗腫瘤活性，其中化合物2對胃癌SGC-7901和神經膠質瘤細胞U-87有較強抗腫瘤活性(IC50值分別為25.37、33.34 μmol/L)，化合物6對SGC-7901、HepG2及U-87三種細胞均有較強抗腫瘤活性(IC50值分別為23.95、82.15、31.89 μmol/L)，化合物8對胃癌SGC-7901細胞有較強抗腫瘤活性(IC50值為50.08 μmol/L)。

綜上所述，本文通過對樺褐孔菌抗腫瘤活性單體的分離、結構鑒定及抗腫瘤活性研究，為深入探索樺褐孔菌抗腫瘤細胞作用機制提供了科學依據。