上皮性卵巢癌中V-ATPase與Ki-67的表達及其臨床意義

李澤蓮，楊媛媛，韋雯雯，何 靜，顏士杰，肖 蘭

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)病死率高居女性生殖系統腫瘤首位，確診時多處于晚期，相對其他婦科腫瘤，惡性程度高，III期EOC患者其5年生存率為23%～41%，對于IV期癌癥患者僅為11%[1]。卵巢癌化療耐藥是制約其臨床療效、導致其遠期生存率低的關鍵[2]。腫瘤微環境變化與腫瘤侵襲、進展和耐藥密切相關，而腫瘤組織中液泡膜-ATP酶(vacuolar membrane-ATPase,V-ATPase)表達過量或活性增高是形成腫瘤酸性微環境重要原因之一[3]。Ki-67是與增殖細胞相關的核抗原，有研究[4]顯示淋巴結轉移患者卵巢癌組織中Ki-67表達水平明顯高于未發生淋巴結轉移的患者，且陽性率高，Ki-67表達越高，患者體內的腫瘤細胞增殖速率越快，更易侵襲而發生淋巴結轉移。目前V-ATPase在EOC中表達的臨床意義以及與Ki-67表達相關性尚未見報道。該研究通過免疫組化方法分析V-ATPase和Ki-67在EOC中表達及其與臨床病理特征的關系，旨在探討兩者在卵巢上皮性腫瘤中的表達和意義。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2015年1月～2016年12月在安徽醫科大學第一附屬醫院進行手術切除的75例EOC患者的病理標本(術前均未行放化療或生物治療)。經病理科確診后收集其完整的臨床病理資料。實驗組：年齡(54.15±8.03)歲，卵巢腫瘤按照FIGO的分期標準分為：Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期60例。卵巢腫瘤按照WHO組織學分級標準分為：漿液性腺癌32例，黏液性腺癌38例，其他類型5例。并同期收取非卵巢疾病患者手術切除的正常卵巢組織40例，年齡(52.09±7.32)歲。標本的收集均獲得患者的知情并簽訂知情同意書。有完整的隨訪資料。

1.2方法將患者的臨床病理資料，如年齡、病理類型、臨床分期、腫瘤分級、淋巴轉移、脈管浸潤、腫瘤大小與V-ATPase表達進行比較。并選用Ki-67作為腫瘤細胞標志物，采用免疫組織化學進行檢測。石蠟塊標本連續切片，切片厚4 μm，切片進行抗原修復，經過脫蠟、脫二甲苯、3% H2O2封閉和枸櫞酸修復液微波修復后，一抗V-ATPase-D1(1 ∶500) 、Ki-67(1 ∶600)(美國Santa Cruz公司)孵育4 ℃過夜，次日復溫后，抗兔二抗(1 ∶2 000)37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，顯微鏡下加DAB(5%)顯色。經蘇木精復染、乙醇化、脫水和中性樹膠封片，并在室溫風干后光鏡下觀察。以在細胞質、細胞膜中出現棕褐色細顆粒狀為陽性。免疫組織化學結果依據細胞質或細胞膜中出現棕黃色顆粒為V-ATPase蛋白表達陽性細胞，對于每例均隨機觀察10個高倍視野(×200)，鏡下未觀察到陽性細胞為陰性(-)，鏡下陽性細胞數<5%為弱陽性(1+)，鏡下陽性細胞數5%～25%為陽性(2+)，鏡陽性細胞數>25%為強陽性(3+)。

1.3統計學處理采用SPSS 13.0軟件進行分析。計數資料采用率(%)表示，采用χ2檢驗或者Fisher′s確切概率法進行比較，V-ATPase與Ki-67關系應用Spearman等級相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1EOC組織過表達V-ATPase如圖1所示，EOC組織的胞膜及胞質中均有V-ATPase陽性染色，見棕黃色染色，且著色明顯。但在正常卵巢上皮組織中，V-ATPase蛋白陽性著色淡，主要位于細胞質中，細胞膜不表達。EOC組織陽性表達率與正常卵巢上皮組織V-ATPase蛋白陽性表達率相比(61.3%vs12.5%)，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。相應標記腫瘤細胞標記抗原Ki-67表達與V-ATPase表達呈一致性(圖2)。

圖1 V-ATPase表達 ×200

A：V-ATPase在正常卵巢上皮細胞中的表達為(-)；B～D：V-ATPase在EOC中的表達程度分別為弱陽性(1+)、陽性(2+)、強陽性(3+)

2.2V-ATPase表達與EOC臨床病理的關系V-ATPase表達與EOC患者的年齡、病理類型、脈管浸潤無明顯相關性(P>0.05)，而與EOC FIGO分期(P=0.002)、病理分級(P=0.001)、淋巴結轉移(P=0.020)以及腫瘤大小(P=0.015)有明顯相關性(P<0.05)，見表2。

2.3EOC中V-ATPase和Ki-67的相關性分析經Spearman等級相關分析顯示，V-ATPase與Ki-67蛋白在EOC中呈正相關性(rs=0.238，P<0.05)，見表3。

表1 正常卵巢上皮及EOC組織中V-ATPase及Ki-67陽性表達率比較(n)

圖2 Ki-67表達 ×200

A：Ki-67在正常卵巢上皮細胞中的表達為(-)；B～D：Ki-67在EOC中分別為弱陽性(1+)、陽性(2+)、強陽性(3+)

表2 V-ATPase的表達與EOC臨床病理參數的關系

表3 EOC組織 V-ATPase與Ki-67蛋白的關系(n)

3 討論

目前，卵巢癌仍是威脅女性生殖健康的主要惡性疾病，其發病率有逐年上升趨勢，雖然卵巢癌臨床治療技術已顯著提高，但由于不能早期診斷及術后化療耐藥，總的5年生存率仍無明顯改善。因此，從分子水平上研究卵巢癌發生、發展機制，尋找合理有效的治療靶點，是提高卵巢癌生存率、延長生存期、改善生活質量的關鍵。

V-ATPase位于腫瘤細胞小泡的膜，如溶酶體膜、高爾基體的囊泡膜以及植物液泡膜上，主要參與調節細胞內外的pH值，將腫瘤細胞糖酵解產生的大量H+泵出細胞外，維持腫瘤細胞的生存及其酸性微環境。研究[5-6]表明腫瘤微環境影響微血管形成、腫瘤的生長、侵襲和轉移，影響腫瘤細胞對放療、化療的敏感性，尤其是酸性微環境與腫瘤增殖、轉移和化療耐藥都有關。

本研究中75例EOC組織中V-ATPase陽性表達率為61.3%，在腫瘤細胞膜及細胞質中均表達，同期正常卵巢上皮組織中陽性表達僅為12.5%，故推測V-ATPase高表達與EOC發生有關。分析V-ATPase表達與EOC臨床病理特征的關系，顯示V-ATPase表達與EOC患者年齡、病理類型無明顯相關，而與腫瘤FIGO分期相關(V-ATPase陽性表達率Ⅰ～Ⅱ期為26.7%vsⅢ～Ⅳ期為70%)，提示EOC分期越晚，V-ATPase陽性表達率越高，V-ATPase過表達亦與EOC的發展呈正相關性。本研究中V-ATPase表達與EOC的淋巴結轉移、腫瘤組織的分化程度以及腫瘤大小均顯示顯著相關，提示EOC V-ATPase 高表達的腫瘤增殖較快，較容易發生淋巴結轉移。有動物研究[6]提示，在無胸腺的小鼠腹腔里種植卵巢癌細胞，紫杉醇加奧美拉唑聯合治療相比單用紫杉醇，腫瘤體積明顯降低；另有研究[7]表明抑制V-ATPase 可誘導Bnip3依賴的腫瘤細胞死亡，從而降低腫瘤負荷和轉移。本研究及以上結論均表明V-ATPase高表達與瘤體體積相關。卵巢腫瘤病灶體積<5 cm直徑時CA125不易被檢測到，因而推論V-ATPase比CA125具有更強的靈敏性和特異性。最近的研究[8-10]提示V-ATPase在乳腺癌及胃腸道惡性腫瘤的生長、轉移及侵襲起著重要作用。Ki-67是一種與細胞增殖相關的核抗原，是反映惡性腫瘤細胞增殖活性的重要分子標志物，幾乎表達于所有增殖細胞, 與腫瘤增殖、浸潤轉移及預后關系密切。本研究顯示，V-ATPase過表達病例中Ki-67指數亦呈增高趨勢，V-ATPase和Ki-67抗原表達呈明顯正相關性，即V-ATPase表達水平越高，腫瘤細胞增殖越活躍。V-ATPase導致腫瘤酸性微環境形成，該環境促進EOC細胞異常增殖和惡性轉化。故認為Ki-67可能是V-ATPase調控腫瘤酸性微環境形成, 腫瘤細胞過度增殖標志之一。

V-ATPase異常表達使得腫瘤酸性微環境得以產生及維持，目前以V-ATPase為靶點，糾正腫瘤酸性微環境已成為克服腫瘤耐藥的一種極具潛力的治療手段。Ki-67是一種判斷細胞增殖狀態的指標，將兩者結合起來，對于判斷EOC的預后和腫瘤靶向治療的效果極有意義。