正常小鼠陰道上皮細胞體外原代培養探索

劉燕燕，祁文瑾

女性陰道微生態體系由陰道內的組織結構、微生態菌群，局部內分泌調節功能和免疫功能組成[1]。這是一個非常靈敏的系統,在受到內源性和外源性因素影響時,容易發生改變[2-3]，而導致相關疾病的發生，如細菌性陰道病、外陰陰道假絲酵母菌病和滴蟲陰道炎等，由于直接進行患者陰道局部組織取材研究相對困難，利用體外培養的陰道上皮細胞進行相關研究可能更具可行性。該研究旨在探索一種簡單有效的正常小鼠陰道上皮細胞體外原代培養技術。

1 材料與方法

1.1主要試劑Epilife Medium、0.06 mol/L氯化鈣溶液、HKGS Kit(含胰島素生長因子-1 5 μg/ml，氫化可的松0.18 mg/ml，牛轉鐵蛋白2.5 mg/ml，慶大霉素/兩性霉素B 1 ml，表皮生長因子200 ng/ml，牛腦垂體提取物24 mg/ml)、DMEM/F12、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)均購自美國Gibco公司；0.25%胰酶+0.02%EDTA(美國Gibco公司)；中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ，美國Sigma公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Solarbio公司)；100 U/ml青、鏈霉素(美國Solarbio公司)；兔抗鼠廣譜角蛋白抗體 (Rabbit Anti-P-CK,北京博奧森生物技術有限公司)；細胞角蛋白5/6抗體 (CK5/6，上海江萊生物科技有限公司)；10×多聚賴氨酸 (美國Solarbio公司)。

1.2器材LD5-2A高速離心機(北京雷勃爾公司)，3111型CO2培養箱(美國Thermo公司), CK40-F200倒置顯微鏡(日本OLYMPUS), BHC-1300IIA/B超凈工作臺(美國Thermo公司)。

1.3實驗動物清潔級昆明雌鼠，6～8周，22～28 g，購自昆明醫科大學動物實驗中心，動物合格證編號：SCXK(滇)K2015-0002。

1.4陰道上皮細胞原代培養小鼠稱重記錄后，斷頸處死，頭部向下浸于75%酒精中消毒20 s，防止酒精浸入陰道。在超凈臺內充分暴露小鼠腹部，沿著雙角子宮下端找到陰道，充分剝離周圍結締組織，無菌操作下分別從宮頸口和陰道口處向上5 mm處取1 cm×0.5 cm大小的陰道組織6塊，置于6孔板內，分別用4 ℃含雙抗的PBS徹底清洗，直至PBS不再渾濁后，將陰道組織轉移至新的6孔板內，與2 U/ml的DispaseⅡ 1 ∶2混合，置于4 ℃冰箱過夜。第2天，用眼科鑷分離陰道上皮層和固有層，棄固有層，將上皮層組織與0.25%胰酶-0.02%EDTA按照1 ∶2的體積比混合，放于37 ℃、5% CO2培養箱內孵育10 min后，用無菌槍頭輕輕吹打上皮層30 s后，37 ℃、5% CO2培養箱孵育10 min，再次輕輕吹打上皮層直至在光鏡下沒有成團的細胞，加入與0.25%胰酶-0.02%EDTA同體積的含10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，將所得的細胞懸液通過200目尼龍膜過濾，濾液1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入沉淀細胞團體積10倍的PBS 重懸細胞，離心棄上清液，加入Epilife重懸，使細胞密度達到1×105～1×106個/ml，移入25 cm2培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，2 d后首次換液，以后每2 d換液1次。

1.5傳代培養到第7～9天，細胞密度達80%～90%，進行第1次傳代，棄培養瓶內培養液，加適量的PBS輕輕吹打瓶底，棄上清液，重復2次，加入0.25%胰酶1 ml浸泡細胞表面，37 ℃培養箱內孵育30 min，光鏡下觀察，細胞間隙增大，大部分細胞呈圓球形，加入1 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，用無菌槍頭輕輕吹打瓶底細胞，將細胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入沉淀細胞團體積10倍的PBS重懸細胞，再次離心后，棄上清液，加入與第一次離心時PBS等體積的Epilife重懸，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加2 ml Epilife重懸，以1 ∶2比例轉移至新培養瓶內繼續培養。

1.6陰道上皮細胞的形態學觀察和鑒定

1.6.1光鏡下觀察陰道上皮細胞生長特征并進行HE染色 取原代生長匯合度將近80%～90%的上皮細胞，胰酶消化后，在預先用多聚賴氨酸處理過的玻片上，制作成細胞爬片, PBS液漂洗，用95%乙醇固定，待干后，蘇木精染色5 min，流水洗1 min，75%鹽酸乙醇分化10 s，流水洗1 min，伊紅染色1 min，酒精梯度脫水，透明后,中性樹脂封固,鏡檢。

1.6.2掃描電鏡觀察 原代生長匯合度將近80%～90%的上皮細胞，胰酶消化后，在預先用多聚賴氨酸處理過的24孔蓋玻片上制作細胞爬片, 用PBS液漂洗蓋玻片， 2.5%戊二醛4 ℃固定1 h。PBS液清洗,1%鋨酸固定、脫水,真空鍍膜儀上干燥后噴金,掃描電鏡觀察細胞形態及細胞表面情況。

1.6.3免疫組織化學染色 取原代生長匯合度將近80%～90%的上皮細胞，胰酶消化后，在預先用多聚賴氨酸處理過的玻片上，制作細胞爬片，PBS液漂洗，用95%乙醇固定，分別用P-CK、CK5/6抗體進行免疫細胞化學染色,用0.01% PBS漂洗,再以含生物素標記的第二抗體進行反應,DAB顯色,蘇木精復染,脫水、透明后,中性樹脂封固,鏡檢。

2 結果

2.1陰道上皮原代細胞生長特性觀察和HE染色酶消化的原代陰道上皮細胞24 h后大部分貼壁并逐漸伸展，培養7～9 d,匯合度達80%～90%，具有上皮細胞特性：呈多角形,輪廓清晰,折光性強,呈鋪路石樣生長。見圖1。傳代后細胞生長較快,4～6 d即可融合。HE染色后，胞質呈紅色，細胞核呈藍色，細胞形態成多角形，呈鋪石樣生長。見圖2。

圖1 光鏡下不同培養天數原代陰道上皮細胞貼壁情況 ×10

圖2 HE染色的第4天原代細胞生長情況

2.2電鏡觀察掃描電鏡下上皮細胞呈鑲嵌排列,細胞間界限清楚,表面布滿質膜皺褶微絨毛,呈不規則疏網狀,稱為微絨毛嵴。細胞邊緣因對接而增厚,微絨毛嵴則變密變短,形成清楚的分界線。細胞核呈圓形或橢圓形,見圖3。

圖3 掃描電鏡下不同培養天數原代陰道上皮細胞形態

A：原代第2天 ×2 000；B: 原代第4天 ×1 000;C：原代第6天 ×1 000; D：原代第8天 ×300

2.3免疫細胞化學染色經P-CK染色的細胞，胞質呈棕黃色，均為廣譜角蛋白陽性細胞，見圖4。表明所有細胞均為上皮細胞，少有成纖維細胞污染。經CK5/6染色的細胞，胞質成棕黃色，均為CK5/6陽性細胞，見圖5。進一步表明所有細胞均為鱗狀上皮細胞。

圖4 P-CK染色的細胞

A:光鏡下原代細胞第4天 ×40 ;B:光鏡下原代細胞第4天 ×20

圖5 CK5/6染色的細胞

A：光鏡下原代細胞第4天 ×40； B：光鏡下原代細胞第4天 ×20

3 討論

小鼠陰道黏膜由復層鱗狀上皮細胞所覆蓋，受卵巢雌、孕激素的影響而有周期性變化；雌激素使上皮細胞增生、角化，孕激素使陰道上皮細胞脫落加快。陰道黏膜的基底層細胞具有較強的增殖能力,因此暴露并分離出基底層細胞是一個關鍵環節。該研究采用的DispaseⅡ是一種中性蛋白酶,可選擇性地分解基底膜Ⅳ型膠原和纖維黏連蛋白,不破壞上皮間的細胞連接,與胰酶相比,可以完整的分離陰道上皮層,更好地保留基底細胞層,從而獲取更多的增殖細胞[4]。用DispaseⅡ和胰酶分步消化后,陰道上皮細胞24 h后開始貼壁,3～5 d增殖迅速,7～9 d可融合至80%～90%，大大縮短了原代培養的周期。

陰道上皮體外繁殖能力低,對培養環境要求較高,目前報道過的上皮細胞培養基有1640[5]、DMEM+F12[6]、K-SFM[7-10]、DK-SFM[11-12]和Epilife[13]。前兩種培養基中都加入了胎牛血清，由于血清促進細胞增殖分化的作用，使細胞易于老化，減少細胞傳代次數，使成纖維細胞優勢生長，不利于上皮細胞的生長。且需要經過傳代1～2次，才能獲得純化高的陰道黏膜干細胞，培養周期長，經濟成本大。不少國內外報道[7-9]用K-SFM培養陰道上皮、口腔上皮、牛汗腺等上皮細胞。在本實驗的預實驗中選用了K-SFM培養基，但近期因國內禁止進口導致貨源不穩定而停用，而選用DK-SFM培養，細胞增殖不是很理想，很有可能與該培養基supplement成分中的BPE是人工合成，缺少生物活性有關。Sch?n et al[13]在培養人宮頸上皮細胞選用Eplife，加用HKGS和0.4 mmol /L氯化鈣， Hammiller et al[14]建議在培養小鼠上皮細胞的培養基的氯化鈣濃度為0.02～0.09 mmol /L，故該實驗取用Eplife加用HKGS和0.02 mmol /L氯化鈣獲得了純度高、可傳3～4代的陰道上皮細胞。

該實驗培養的陰道上皮細胞光鏡下呈多角形,大小均一,融合成片后緊密排列如鋪路石樣,通過掃描電鏡從二維視覺動態觀察陰道上皮細胞貼壁生長的形態學，隨著培養時間延長，由水滴狀慢慢延展為多角形，達到接觸抑制。細胞表面可見許多微絨毛和脊樣胞質皺褶,符合典型的上皮細胞特點。從而提示在酶消化后靜置培養箱培養的重要性，讓有活力的陰道上皮細胞充分貼壁生長，在培養初期換液需輕柔，而非為了減少成纖維細胞成長過早、過頻地吹壁、換液。P-CK和CK5/6免疫細胞化學染色陽性,進一步證實為鱗狀上皮細胞。

該實驗在對培養基的改良后培養出純度較高、可傳3～4代的陰道上皮細胞，為后期進行女性生殖道微生態系統失調而導致相關陰道感染疾病的研究奠定了良好的基礎。