胰腺癌中細胞周期依賴激酶抑制劑3的表達及意義

胡贊 孫銳 程方雄 曾吉 葉俊

武漢市第四醫院，華中科技大學同濟醫學院附屬武漢普愛醫院1檢驗科，2腫瘤內科（武漢430077）

胰腺癌是一種惡性程度極高的惡性腫瘤，5年生存率不足8%［1］。在我國胰腺癌引起的病死率占所有惡性腫瘤死亡原因的第6位，且發病率以每年2.3%的速度遞增［2］。細胞周期依賴激酶抑制劑 3（cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3）為雙特異性蛋白磷酸酶家族成員，可使CDK1/2去磷酸化并失活［3-4］。據報道，CDKN3表達異常與多種惡性腫瘤的發生、發展密切相關，但其在胰腺癌中的表達鮮有報道［3-4］。本研究旨在探討CDKN3在胰腺癌中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2010年1月至2016年6月我院及湖北省腫瘤醫院行胰腺癌根治術的初診胰腺癌患者29例，取癌組織及配對癌旁組織（距離腫瘤邊緣5 cm以上），其中男17例，女12例，平均年齡為58.2歲。所有患者術前均未接受放化療及靶向治療，且經術后病理學明確診斷。

1.2 生物信息學檢索訪問并下載GEO數據集中胰腺癌GSE28735數據，分析CDKN3 mRNA在癌及癌旁組織表達差異性。

1.3 Western blot檢測CDKN3蛋白表達用PIPA蛋白裂解液裂解細胞，提取總蛋白并測定蛋白含量。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉膜，待封閉、洗膜后依次與一抗、二抗孵育，洗膜后曝光檢測。鼠抗人CDKN3單克隆抗體購自美國Abcam公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體，HRP標記的二抗購自美國Thermo公司。

1.4 免疫組織化學染色取手術切除的胰腺癌及癌旁組織，經固定、脫水、透明、包埋、切片、烤片、抗原修復、封閉后，依次加入一抗、二抗孵育后顯色。由兩位病理科醫師采用盲法判定陽性。CDKN3主要定位于細胞漿，陽性呈現棕黃色或棕褐色。

1.5 細胞培養與轉染吉瑪生物科技有限公司設計和合成CDKN3 siRNA，其序列如下5′-AAAC-CACCAGUGUUAUCAAUU-3′；對照siRNA序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′［4］。取對數生長期細胞運用Lipofectamine2000（invitrogen）試劑盒進行轉染，參照試劑盒說明書進行操作。

1.6 細胞遷移實驗取對數生長期細胞制成懸液，Transwell小室上室加細胞懸液及血清培養基各 100 μL，下室加 800 μL 完全培養基，培養 24 h后取出并棄液、固定、染色，沖洗后用顯微鏡觀察。

1.7 統計學方法使用SPSS 17.0進行統計學分析，細胞遷移率比較采用兩獨立樣本t檢驗；CDKN3表達與臨床特征的關系分析采用Fisher精確概率檢驗法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學訪問GEO數據集胰腺癌GSE28735數據庫，通過統計學分析發現胰腺癌組織CDKN3 mRNA表達水平明顯高于配對癌旁組織（圖1）；生存分析結果顯示，高CDKN3表達胰腺癌患者生存期顯著低于低CDKN3表達患者（圖2），即高CDKN3表達提示預后不良。

圖1 CDKN3 mRNA在胰腺癌及配對癌旁組織表達水平Fig.1 CDKN3 expression level in pancreatic cancer tissue and adjacent tissue in database GSE28735

圖2 生存分析結果Fig.2 Survival analysis results

2.2 胰腺癌組織CDKN3蛋白的表達Western blot檢測29例配對胰腺癌和癌旁組織中CDKN3蛋白的表達。結果顯示，其中23例（79.3%）胰腺癌組織CDKN3蛋白表達水平顯著高于癌旁組織（圖3），差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖3 4例配對的腺胰癌組織（T）及癌旁組織（N）中CDKN3蛋白表達情況Fig.3 The expression of CDKN3 in 4 paired pancreatic cancer tissues and adjacent tissues

2.3 CDKN3蛋白在胰腺癌組織中的表達CDKN3蛋白陽性反應主要定位于細胞質。免疫組化結果顯示，在29例配對組織中的21例，CDKN3在胰腺癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織（圖4）。

圖4 CDKN3在胰腺癌及癌旁組織中的表達（×400）Fig.4 Representative photographs of staining of CDKN3 protein in a pair of pancreatic cancer and adjacent tissues

2.4 細胞遷移實驗體外運用si-RNA敲低Panc-1胰腺癌細胞系中CDKN3的表達，使用Transwell小室檢測CDKN3敲低表達對細胞遷移能力的影響。結果顯示，CDKN3敲低顯著降低Panc-1胰腺癌細胞的遷移能力（P ＜0.01）（圖5）。

2.5 胰腺癌組織CDKN3表達水平與臨床特征的關系將29例癌組織CDKN3表達水平排序，并取高、低CDKN3表達樣本各14例，分析CDKN3表達水平與臨床特征之間的關系。結果顯示CDKN3表達水平與胰腺癌患者性別、年齡均無關；高CDKN3表達患者淋巴結轉移比率高、TNM分期高（P ＜ 0.05）（表1）。

3 討論

CDKN3被證實參與調節細胞周期過程［5］。研究證實，CDKN3在乳腺癌［4］、胃癌［6］、前列腺癌［7］中高表達，并通過不同的信號通路，調節癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等細胞生物學行為。CDKN3在乳腺癌中可作為原癌基因，通過靶向抑制下游PCNA、RhoA及Bcl-2的表達，調控細胞乳腺癌細胞的增殖、遷移及細胞周期［4］；此外，在胃癌細胞中敲低CDKN3可降低CDK2、CDC25A、CCNB1及CCNB2等下游基因的表達，可降低癌細胞的增殖、遷移、侵襲和黏附能力，并可誘導癌細胞阻滯于G0～G1期［6］；在前列腺癌中，CDKN3表達水平與患者生存率呈顯著負相關；敲低其表達可顯著促進細胞停滯在G1期，癌細胞凋亡率升高、侵襲能力降低。

圖5 轉染CDKN3 siRNA后Panc-1細胞遷移能力變化Fig.5 Cell migration was assessed by transwell assay in Panc-1 cells after transfected with CDKN3 siRNA

表1 CDKN3在胰腺癌組織中的表達與部分臨床特征的關系Tab.1 Correlation between the CDKN3 expression and the clinicopathologic features of the pancreatic cancer例

有趣的是，CDKN3在一些惡性腫瘤中表達上調，而在另一些惡性腫瘤中表達下調。CDKN3被證實在肝癌［8］及膠質母細胞瘤［9］中表達缺失或下調。CDKN3表達水平與肝癌的病理分期呈顯著負相關，抑制其表達可顯著增強肝癌細胞的克隆能力及對化療藥物的耐受能力［8］。敲低CDKN3表達可導致p53和p21表達下調，而AKT1激酶表達上調。CDKN3可能通過AKT/P53/P21信號通路增強肝癌細胞生存能力［8］。

本課題組首次利用生物信息學預測，并通過實驗證實胰腺癌組織CDKN3表達水平明顯高于配對癌旁組織；此外通過遷移實驗證實，敲低CDKN3顯著降低胰腺癌細胞的遷移能力；最后統計分析得出，高CDKN3表達提示高淋巴結轉移率及高TNM分期，高表達CDKN3提示胰腺癌患者預后不良。本課題組后期擬深入探索CDKN3調控胰腺癌細胞遷移轉移的分子機制，為胰腺癌的治療提供理論基礎。