DLL1基因在乳腺癌及三陰性乳腺癌中的表達及其臨床意義

吳玨堃 熊志勇 阮瑩 劉宇

1中山大學附屬第三醫院甲狀腺乳腺外科（廣州510630）；2中山大學附屬第三醫院嶺南醫院普外科（廣州510630）

乳腺癌是女性最常見、病死率最高的惡性腫瘤之一［1］。乳腺癌的發生與遺傳、激素影響、生活方式等因素相關，但其具體發病機制尚未明確。乳腺癌的發生發展過程復雜，涉及多條信號通路。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer）是一種侵襲性乳腺癌亞型，指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）均表達陰性的乳腺癌分子分型，其病理分期更差、患者生存率更低［2］。與激素陽性乳腺癌相比，現有的化療及靶向治療方案對三陰性乳腺癌作用有限［3］。

Notch信號通路是一種進化上高度保守的通路，在胚胎發育和組織穩態維持過程中起著至關重要的作用。異常的Notch信號轉導與多種人類遺傳病以及腫瘤生物學的多個方面有關，包括干細胞更新、癌細胞增殖、腫瘤血管生成和轉移［4］。研究表明Notch信號通路可調控乳腺癌及乳腺癌干細胞的增殖、分化和凋亡［5］，Notch信號作為許多疾病的潛在治療靶點得到了越來越多的關注，針對Notch信號通路的靶向治療藥物也有可能給乳腺癌的治療帶來新方向。

目前對Notch信號通路中的DLL1基因在乳腺癌中的表達及作用鮮有報道，本研究通過腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫，研究DLL1在乳腺癌及三陰性乳腺癌中的表達差異的臨床意義及對預后生存的影響，為進一步研究DLL1在腫瘤發生發展中的作用機制提供線索和思路。

1 材料與方法

1.1 數據資料收集利用Bioconductor/TCGAbiolinks函數包從TCGA數據庫（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga）下載并預處理乳腺癌及三陰性乳腺癌數據集的mRNA表達數據，利用Kaplan-Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis/index.php？p=service&cancer=breast）在線分析DLL1與乳腺癌及三陰性乳腺癌患者預后的相關性。

1.2 數據集的篩選和臨床資料參數相關性研究提取TCGA數據集中乳腺癌及三陰性乳腺癌病例中的臨床參數和生存資料數據。根據DLL1表達量的資料，將數據按照中位數二等分，分別設為高表達組和低表達組。

1.3 統計學方法計量資料以均數±標準差表示，應用SPSS 17.0統計軟件分析。均數比較采用t檢驗和方差分析，基因表達與患者臨床病理參數之間的關系采用Pearson卡方檢驗。

2 結果

2.1 DLL1基因在乳腺癌和三陰性乳腺癌中的表達利用TCGA的數據我們分析了DLL1基因在113例正常乳腺組織、1 090例乳腺癌及66例三陰性乳腺癌中mRNA的表達情況（圖1），DLL1在乳腺癌中的相對表達水平為2.28±0.07，明顯低于正常乳腺組織的相對表達水平3.83±0，14（t=7.471，P＜0.01）。DLL1在三陰性乳腺癌中的相對表達水平為2.07±0.24，明顯低于正常乳腺組織的相對表達水平（t=6.789，P＜0.01）。DLL1在乳腺癌中的相對表達水平與三陰性乳腺癌的差異無統計學意義（t=0.773，P=0.44）。

圖1 DLL1基因在乳腺癌和三陰性乳腺癌中的表達水平Fig.1 Expression of DLL1 gene in breast cancer and triplenegative breast cancer

2.2 DLL1表達與臨床病理資料相關性在乳腺癌中，DLL1的表達與ER、PR、年齡、病理組織類型的相關性差異有統計學意義（P＜0.01），與HER2、絕經、種族、遠處轉移、淋巴結轉移相關性差異無統計學意義（P＞0.05）。在三陰性乳腺癌中，DLL1的表達與年齡、病理組織、絕經、種族、遠處轉移、淋巴結轉移均無明顯相關性（表1）。

2.3 DLL1表達與乳腺癌及三陰性乳腺癌預后的相關性為分析DLL1的表達與乳腺癌預后的相關性，本研究從TCGA數據庫中下載了乳腺癌DLL1 mRNA表達數據和相應腫瘤患者生存時間數據，利用Kaplan-Meier Plotter對這些腫瘤的數據集進行在線生存分析。結果發現，DLL1的表達與乳腺癌患者的總生存期（HR=0.65、P=0.018）（圖2）、無病生存期（HR=0.59、P＜0.001）（圖3）有相關性，DLL1表達越低，乳腺癌患者總生存時間和無病生存時間更短。在三陰性乳腺癌中，由于總生存期數據較少無法統計分析，DLL1的表達與三陰性乳腺癌患者的無病生存期（HR=1.77、P=0.038）有相關性（圖4），在三陰性乳腺癌患者中，DLL1表達越低，乳腺癌患者無病生存時間更長。

3 討論

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體（DSL蛋白）、CSL（CBF-1，suppressor of hairless，Lag的合稱）DNA結合蛋白、其他的效應物和Notch的調節分子等組成。哺乳動物有4種Notch受體（Notch1～4）和5種Notch配體（Delta-like 1，3，4，Jagged1和Jagged2）［7］。Notch 信號通路在進化上十分保守，存在于許多動物體內。Notch位于細胞信號通路的交匯點，通過受體與配體的相互作用傳遞細胞信號，在細胞增殖、分化、凋亡中發揮重要作用。包括癌癥在內的許多人類疾病，都存在Notch信號的調控錯誤［8］。

表1 DLL1表達與乳腺癌及三陰性乳腺癌臨床病理特征的相關性Tab.1 Correlation between DLL1 expression and clinicopathological features of breast cancer and triple-negative breast cancer 例

在腫瘤的發生發展中Notch信號通路發揮了重要的作用，其中DLL1在肺癌［9］、胰腺癌［10］、膠質母細胞瘤［11］等多種腫瘤中表達異常，但DLL1在乳腺癌中的作用如何目前研究較少。

乳腺干細胞在乳腺發育及乳腺癌的發生中起著重要作用，研究表明乳腺干細胞能夠產生大量的DLL1，DLL1與Notch2和Notch3受體的結合對保持乳腺細胞處于干細胞狀態及其微環境中的巨噬細胞數量至關重要，同時DLL1的表達導致巨噬細胞表達Wnt3、Wnt10和Wnt16基因，這種發生在乳腺干細胞微環境中的“Notch-Wnt交談”對乳腺發育是至關重要的，這種機制也可能對乳腺癌產生，因為在乳腺癌中這些信號傳導通路的活性異常增加［12］。

圖2 DLL1表達對乳腺癌總生存期影響Fig.2 Effect of DLL1 expression on overall survival of breast cancer

圖3 DLL1表達對乳腺癌無病生存期影響Fig.3 Effect of DLL1 expression on breast cancer free survival

圖4 DLL1表達對三陰性乳腺癌無病生存期影響Fig.4 Effect of DLL1 expression on three negative breast cancer free survival

本研究利用TCGA的數據分析了DLL1基因乳腺癌中mRNA的表達情況發現DLL1在乳腺癌及三陰性乳腺癌中均均明顯低于正常乳腺組織。進一步結合臨床病理資料分析，發現在乳腺癌中，DLL1在不同ER、PR、年齡、病理組織類型的表達差異有統計學意義，在不同HER2、絕經、種族、遠處轉移、淋巴結轉移的表達差異無統計學意義。在三陰性乳腺癌中，DLL1在年齡、病理組織、絕經、種族、遠處轉移、淋巴結轉移的表達差異均無統計學意義。生存分析顯示DLL1表達越低，乳腺癌患者總生存時間和無病生存時間更短，但是在三陰性乳腺癌患者中，DLL1表達越低，乳腺癌患者無病生存時間更長。雌激素受體、孕激素受體的相關性預示著DLL1在三陰性乳腺癌中的可能發揮的不同的作用機制，在三陰性乳腺癌中，低表達DLL1反而無病生存期更差，表明DLL1在三陰性乳腺癌的復發機制中可能有所不同。

現有的研究對DLL1的功能了解很少，本文通過生物信息學分析為DLL1基因的功能學研究提供了基礎。本研究的不足之處在于TCGA數據庫提供的是mRNA表達水平的數據，不能完全替代蛋白水平的表達情況，后續研究應進一步在臨床樣本中綜合mRNA和組織蛋白層面驗證DLL1的表達情況，并在體內外實驗中檢測DLL1表達差異對乳腺癌功能的有無影響。綜上所述，DLL1在乳腺癌的發生發展中有著密切相關性，對其深入的研究可進一步揭示其在乳腺癌中的功能及作用機制，深入的研究可為腫瘤的預防和治療提供新的思路。