Pb、Cd和酸脅迫對寬葉雀稗種子萌發、幼苗生長及抗氧化酶活性的影響

陳順鈺， 趙雅曼， 李宗勛， 韓 航， 侯曉龍,2,3*， 蔡麗平,2,3

(1. 福建農林大學林學院， 福建 福州350002； 2. 海峽兩岸紅壤區水土保持協同創新中心， 福建 福州350002；3. 南方紅壤區水土保持國家林業局重點實驗室， 福建 福州350002)

隨著社會經濟的發展，人類對礦產資源的需求不斷增加。其中對礦產資源的不合理開發，誘發地質災害、破壞生態環境，造成礦山及其周圍環境的污染，對人類的生產生活造成了嚴重的影響[1-3]。礦山廢棄地環境污染問題成為環境科學界研究熱點，廢棄地生態亟待修復。其中植物修復技術具有安全經濟、綠色環保等優點備受廣泛關注[4-5]。福建長汀屬離子型稀土礦區，在酸性條件下重金屬易被活化，且酸性越強釋放速度越快。長汀稀土開采時加入大量的硫酸銨或草酸就地淋浸，造成大量土壤pH值低的廢棄地、土壤重金屬污染嚴重，同時引起植被破壞、水土流失[6]。長汀重金屬污染主要為Pb、Cd，Pb在原地浸廢棄地、周邊未開采地達中度污染水平，在取土場中達輕度污染水平，廢棄堆浸池達重度污染水平；Cd在原地浸廢棄地、取土場、廢棄堆浸池的質量比分別為福建省土壤背景值的141倍、97 倍、69倍；4個采樣區土壤Cd均達重度污染水平，綜合潛在生態風險指數達極重污染水平[7-9]。

寬葉雀稗(PaspalumwettsteiniiHack)屬禾本科(Gramineae)黍亞科(SubFam. Panicoideae)雀稗屬(Paspalum)，是半匍匐熱帶型多年生禾草，具有耐旱、耐瘠薄，耐酸、耐鹽堿的強抗逆性，且根系發達，生長速度快，分蘗力和再生力強。寬葉雀稗以其優良的特性成為南方水蝕荒漠化地區、礦山廢棄地、道路邊坡等生態惡地植被恢復中理想的先鋒植物[10-12]。當前對寬葉雀稗的研究主要集中在水土保持、耐鹽抗旱性、破除種子休眠特性等方面[13-14]。王友生等[15]研究發現寬葉雀稗可在土壤Pb、Cd污染嚴重及酸化嚴重的長汀稀土礦廢棄地正常生長，且已成為長汀植被恢復的主要草種之一，其可能存在特殊的形態生理適應機制。但Pb、Cd及酸脅迫對寬葉雀稗種子的萌發和生理適應策略尚不清楚。

因此，本研究以寬葉雀稗為研究對象，設置不同梯度Pb、Cd、酸脅迫試驗，探討Pb、Cd及酸脅迫對寬葉雀稗種子萌發特性和幼苗生長及抗氧化酶活性的影響。同時利用隸屬函數法，綜合評價不同逆境脅迫條件對寬葉雀稗種子萌發及幼苗生長的影響程度，以期為酸性礦山廢棄地和土壤重金屬污染地區的植被恢復提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗材料為寬葉雀稗種子，購自廈門三水園林綠化工程有限公司。用0.3%高錳酸鉀溶液消毒浸泡寬葉雀稗種子30 min后，超純水沖洗6遍，然后用超純水浸泡24 h，除去漂浮的劣質種子，余下的種子用濾紙吸干表面的水分，用于脅迫試驗。

1.2 試驗條件及方法

根據稀土礦廢棄地重金屬污染及土壤酸化程度，設置Cd、Pb濃度及pH值[16-19]，Cd、Pb脅迫采用分析純(CH3COO)2Cd·3H2O、(CH3COO)2Pb配制，濃度分別為：0(以去離子水對照)、25，50，100 mg·L-1，250，500，1 000 mg·L-1(文中以CK,Cd-25,Cd-50,Cd-100,Pb-250,Pb-500,Pb-1000表示)；pH調節采用CH3COOH，分別為3.5，4.5，5.5，CK(對照)。培養條件為溫度25℃、空氣相對濕度70%、光照14 h黑暗10 h、光強100%(RXZ-160A智能型人工氣候箱—寧波江南儀器廠)。鋪有兩張濾紙的直徑9 cm的玻璃培養皿，經過高溫滅菌處理，編號，分別加5 mL各設置濃度的Cd、Pb和酸溶液，每個培養皿50粒種子，每個脅迫濃度6個重復，其中3個重復用于測定幼苗形態學指標，另外3個重復用于測定萌發過程中抗氧化酶活性及MDA含量。每天稱重法補水，保持濾紙濕潤。每天觀察記錄種子萌發情況。

1.3 測定指標與方法

1.3.1種子發芽指標測定 每24 h對發芽情況進行統計記錄，以種子露白為發芽標準。參試種子連續3 d不發芽時計算發芽率，發芽結束。發芽指標參照王文娟等[14]方法：

發芽率=萌發種子數/種子總數×100%

發芽指數=∑Gt/Dt(Gt指在t時間內萌發數，Dt為相應的萌發天數)

發芽勢=發芽7 d萌發的種子數/種子總數×100%

活力指數=發芽指數×苗長度

1.3.2形態學指標測定 第14 d發芽結束，從用于測幼苗形態學指標的培養皿中各取出20株長勢一致的幼苗，用游標卡尺測量幼苗地上部分長及根長，讀數精確到0.01 mm；用電子天平稱幼苗的地上部與根的鮮重，再置于烘箱105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重，稱各部分干重。

1.3.3生理指標測定 發芽第4 d、7 d和10 d，從用于測生理指標的各濃度培養皿中取出0.2 g發芽種子，于冰浴中的研缽內研磨成勻漿，加入4 mL 0.05 mol·L-1(pH=7.8)磷酸緩沖液于離心管中，于4℃下10 000 rpm冷凍離心20 min，取上清液立即放入4℃冰箱儲存待測。參考王學奎[20]的方法測定丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法。紫外吸收法測發芽種子過氧化氫酶(CAT)活性。愈創木酚法測過氧化物酶(POD)活性。氮藍四唑光化還原法測定超氧化物岐化酶(SOD)活性。用多功能酶標儀(IPBPinite M200 PRO，瑞士)測定各指標的吸光度值。

1.4 數據分析

試驗數據收集整理后，用SPSS 19.0進行統計分析，用Origin 9.0作圖。采用單因子方差分析(One-way ANOVA)和多重比較法進行統計分析，用Tukey-HSD法對數據進行差異顯著性分析，P<0.05表示處理間數據差異顯著。

采用模糊數學中的隸屬函數值法對3種脅迫條件下寬葉雀稗種子萌發和幼苗生長進行綜合性評價，參考馬彥霞[21]等方法，公式如下：

如果指標與抗逆性呈正相關X(ij)=(Xij-Xj min)/(Xj max-Xj min)

如果指標與抗逆性呈負相關X(ij)=1-(Xij-Xj min)/(Xj max-Xj min)

式中：X(ij)表示i種類j指標的隸屬函數值；Xij表示i種類j指標的測定值；Xj max、Xj min分別表示j指標的最大值和最小值。

Mi=∑X(ij)式中：Mi表示第i類型的綜合隸屬函數值。

2 結果與分析

2.1 Pb、Cd、酸脅迫對寬葉雀稗種子萌發的影響

隨Pb脅迫濃度增加發芽率、活力指數依次顯著降低(P<0.05)，高濃度的重金屬Pb(≥500 mg·L-1)處理的發芽勢、發芽指數顯著低于對照(表1)。低濃度Cd脅迫(Cd-25)發芽率與對照相近且無顯著差異，Cd-100脅迫處理的發芽指數顯著低于對照，隨Cd脅迫加強發芽勢與活力指數依次顯著減小。而酸處理對寬葉雀稗種子發芽率、發芽勢、發芽指數均無顯著影響。pH-4.5、pH-5.5處理下活力指數均高于對照，其中pH-4.5處理顯著高于對照，pH-3.5處理則相反。由此可見，除Cd-25外其余濃度重金屬Pb、Cd脅迫對寬葉雀稗種子萌發具有顯著的抑制作用，pH-4.5處理對寬葉雀稗種子活力指數起著促進作用。

表1 不同脅迫處理對寬葉雀稗種子萌發的影響Table 1 Seed germination of Paspalum wettsteinii under different treatments

注：不同小寫字母表示不同處理濃度間差異顯著(P<0.05)，下同

Note:Different lowercase letters within same column indicate significant differences at the 0.05 level,the same as below

2.2 Pb、Cd和酸脅迫對寬葉雀稗種子幼苗的影響

隨重金屬Pb、Cd濃度的增加，寬葉雀稗幼苗出現不同程度的毒害效應。如圖1所示，對照幼苗生長良好，根系發達有較多側生根；Pb、Cd脅迫下寬葉雀稗幼苗出現發育不良，芽苗幼小，主根變短甚至出現“無根苗”現象。由表2可知，隨重金屬Pb、Cd脅迫濃度的加強，寬葉雀稗根系和地上部的鮮/干重、長度均呈遞減趨勢，并顯著低于對照(P<0.05)。由于高濃度(Pb-1000及Cd-100)脅迫發芽率低并出現“無根苗”和芽苗幼小癥狀，所以Pb-1000及Cd-100處理下樣品太少導致測量不出重量及長度。可見Pb-1000及Cd-100脅迫是寬葉雀稗種子萌發及幼苗生長的耐受限。

隨pH值減小，地上部的鮮/干重、長度及根鮮重、長度均呈先增加后減少趨勢，在pH-4.5達最大值并顯著高于對照，分別比對照提高了94.54%,36.49%,52.96%,85.61%,51.97%，組間差異顯著(P<0.05)。說明pH-4.5促進寬葉雀稗幼苗的生長發育。

圖1 發芽第14天不同脅迫處理下的寬葉雀稗幼苗Fig.1 Paspalum wettsteinii seedlings growing for fourteenth days under different treatments

表2 不同脅迫處理對寬葉雀稗幼苗的影響Table 2 Effects of different treatments on Paspalum wettsteinii seedlings

2.3 種子萌發過程中抗氧化酶活性的變化

隨Pb脅迫濃度的增加(表3)，發芽第4 d對照的POD活性顯著高于脅迫處理(P<0.05)，并呈遞減趨勢，對照的CAT活性顯著低于脅迫處理，呈先增后減變化并在Pb-500達到最大值，相比對照提高2.26倍。第7 d時對照的SOD活性顯著(P<0.05)高于脅迫處理，并呈遞減趨勢，對照的POD活性顯著(P<0.05)低于脅迫處理并呈先增后減趨勢，CAT活性變化規律則相反，在Pb-1000時達最大值。

SOD活性隨時間的變化，呈遞增趨勢。POD活性變化規律則與SOD活性相反。CAT活性隨時間增加先增后減，在第7 d達最大值并顯著高于第4,10 d的CAT活性。可見發芽初中期(4,7 d)POD、CAT活性增加，保證了寬葉雀稗種子在Pb脅迫下的萌發，發芽后期(10 d)SOD活性相比前兩個發芽階段顯著增加，SOD在后期萌發過程中起主導作用。

由表4可知，隨Cd濃度的增加，第4 d時Cd-100的SOD、CAT活性顯著高于對照(P<0.05)，呈先減后增趨勢，第4 d的POD活性及第7 d的SOD活性均表現出對照顯著高于脅迫處理。第7 d時Cd-100的POD活性顯著高于對照并提高51.66%，CAT活性先增后減，其中Cd-50處理顯著高于對照，相比對照增加了104.19%。

隨發芽時間的變化，第10 d的SOD活性顯著(P<0.05)高于第4,7 d(除Cd-25外)，Cd脅迫下POD、CAT活性變化與Pb處理類似，第4 d的POD活性顯著高于第7,10 d的POD活性。CAT先增加后減少，并在第7 d達最大值且顯著高于第4,10 d的CAT活性。

表3 Pb脅迫下寬葉雀稗種子萌發過程中抗氧化酶活性的變化Table 3 Changes of antioxidant enzyme activities during seed germination in different Pb treatments of Paspalum wettsteinii

注：不同大寫字母表示同一濃度不同萌發時期間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一萌發時期不同濃度間差異顯著(P<0.05)，下同

Note:Different capital letters indicate significant differences among different times under the same concentration at the 0.05 level;different lowercase letters show significant differences of the same time under different concentrations at the 0.05 level,the same as below

表4 Cd脅迫下寬葉雀稗種子萌發過程中抗氧化酶活性的變化Table 4 Changes of antioxidant enzyme activities during seed germination in different Cd treatments of Paspalum wettsteinii

表5 pH脅迫下寬葉雀稗種子萌發過程中抗氧化酶活性的變化Table 5 Changes of antioxidant enzyme activities during seed germination in different pH treatments of Paspalum wettsteinii

隨pH值減小，第4 d時pH-4.5的SOD活性顯著高于對照(P<0.05)，對照的POD活性顯著高于脅迫處理，而對照的CAT活性顯著低于脅迫處理，呈先增加后減少趨勢，并在pH-5.5處理下CAT達最大值是對照的3.19倍。第7 d時對照的SOD、POD活性顯著高于脅迫處理，且均呈先降后升的趨勢。第10 d時對照的SOD活性顯著高于脅迫處理且組間差異顯著，POD活性則相反，對照顯著低于脅迫處理(P<0.05)。

隨萌發時間的延長，第4 d的POD活性顯著高于第7d的POD活性，SOD活性則相反，CAT先增加后減少，第7 d的CAT活性顯著高于第4,10 d的CAT活性。

2.4 寬葉雀稗種子萌發過程中MDA含量

寬葉雀稗種子萌發過程中MDA含量變化如表6所示，隨Pb脅迫加強，萌發各階段(第4,7,10 d)Pb-1000均顯著高于對照(P<0.05)，分別是對照的1.82倍、15.5倍、5.75倍。第4,7 d時Cd-100處理MDA含量均顯著高于對照(P<0.05)，第7,10 d時pH-3.5處理下MDA含量均顯著高于對照。3種脅迫下MDA含量隨時間的變化均在第4 d時最大，整體呈遞減趨勢。

表6 不同處理下寬葉雀稗種子萌發過程中丙二醛MDA/μmol·g-1含量的變化Table 6 Changes of MDA content during seed germination in different treatments of Paspalum wettsteinii

2.5 三種脅迫下寬葉雀稗種子萌發和幼苗生長的抗逆性綜合評價

單獨的指標不能全面判斷3種逆境脅迫條件對寬葉雀稗種子萌發及幼苗生長的影響，通過綜合隸屬函數值可將各指標綜合起來判斷其影響。從表7可以看出，各脅迫處理下寬葉雀稗種子及幼苗各測定指標的綜合隸屬函數值大小為pH-4.5>pH-5.5>CK>pH-3.5>Pb250>Cd-25>Cd-50>Pb500>Cd-100>Pb1000，其中pH-4.5,pH-5.5處理綜合隸屬函數值均高于CK，分別比對照提高了26.68%,7.59%，可見兩種弱酸(pH-4.5,pH-5.5)對寬葉雀稗種子萌發及幼苗生長有一定促進作用。重金屬處理組綜合隸屬函數值均低于CK，說明重金屬處理均對寬葉雀稗種子萌發及幼苗生長產生不同程度的抑制作用，其中Cd-100(1.921)、Pb1000(1.543)處理分別比對照降低76.26%,80.93%，可見高濃度的Pb、Cd脅迫對寬葉雀稗有較強的毒害作用。

3 討論

種子萌發和幼苗階段是植物生命周期中對環境脅迫相對比較敏感的階段[22]。通過觀察逆境脅迫對種子萌發和幼苗生長的影響，可以在一定程度上反映該植物對逆境脅迫的耐性[23]。張大鵬等[24]發現隨Pb2 +和Cd2 +濃度的增加，毛竹(Phyllostachysedulis)種子萌發與濃度呈負相關關系；Pb2 +和Cd2 +對幼苗生長具有顯著的抑制作用。本研究中除Cd-25外，Pb、Cd脅迫對寬葉雀稗種子萌發及幼苗生長均具有顯著的抑制作用，與已有研究基本一致。本研究發現pH-4.5處理對寬葉雀稗種子萌發過程中活力指數、幼苗的生長發育起著促進作用。強酸(pH-3.5)條件下，地上部長和鮮/干重保持相對穩定，表現出對酸脅迫的較強耐性。與同樣可在長汀稀土礦廢棄地正常生長的類蘆(Neyraudiareynaudiana)相類似[9]，類蘆在pH-3.5處理仍能較正常生長；pH-4.5對類蘆根系生長有一定促進作用。同時，在本實驗中發現隨酸脅迫加強，萌發后期的寬葉雀稗種子及幼苗出現發霉情況，其中pH-3.5處理發霉腐爛嚴重，還有待于進一步研究。

表7 不同處理下寬葉雀稗各測定指標的隸屬函數值Table 7 Subordinate function values of each treatment effect on measurement index of Paspalum wettsteinii

種子吸脹過程中各種生理代謝反應旺盛，產生大量的活性氧自由基，導致種子生理活動難以順利進行。以SOD、POD及CAT等為代表的抗氧化酶系統是保證植物種子萌發過程中生理代謝順利進行的必要基礎，亦是評估植物種子適應性的重要指標[25]。只有抗氧化酶系統CAT、POD、SOD三者協調一致，才能使生物自由基維持在一個低水平狀態，從而防止被自由基的毒害[26]。本研究發現隨Pb脅迫加強，寬葉雀稗發芽第4 d的SOD、CAT活性及第7,10 d的POD均呈先增后減趨勢，第7 d的SOD、CAT活性變化規律則相反，這與井瑾等[25]在火棘種子中的研究結果一致。王瑜[27]等發現隨Cd濃度升高，不同狼尾草幼苗SOD、CAT活性增強。本試驗中隨Cd脅迫加強，第4,10 d的SOD、CAT活性先減后增，第7 d時Cd-100處理下POD活性顯著高于對照，此外Cd-50處理的CAT活性同樣顯著高于對照。隨酸脅迫加強，萌發中后期(7,10 d)的SOD活性及萌發初中期(4,7 d)的POD活性均表現出先減后增趨勢，第4,10 d的CAT活性則先增后減。

隨萌發進程的延長，Pb、Cd處理下3種抗氧化酶活性變化規律一致，發芽初中期POD、CAT活性增加，保證了寬葉雀稗種子在重金屬Pb、Cd脅迫下的萌發，發芽后期SOD活性相比前兩個發芽階段顯著增加，SOD在后期萌發過程中起主導作用。酸脅迫時，提高萌發初期POD活性、萌發中期CAT及SOD活性可促進寬葉雀稗種子萌發，同樣在萌發后期SOD活性的提高將O-2轉化為H2O2，減少對細胞造成傷害。抗氧化酶在清除活性氧，減輕脂膜過氧化、適應逆境環境的能力存在差異[28]，但不同抗氧化酶活力相互協同配合，共同保障逆境脅迫下寬葉雀稗種子萌發過程的順利進行。

逆境脅迫會影響植物體內抗氧化酶活性及其化學性質等，活性氧水平上升產生大量丙二醛，造成膜脂過氧化作用，阻礙損害植物正常生長[28]。寬葉雀稗種子在萌發初期(4 d)MDA含量達最大值，隨時間變化MDA含量多呈下降趨勢后略有上升，并隨各脅迫濃度的加強，各階段多呈先增后減趨勢。這與楨楠種子萌發過程中丙二醛變化結果一致，MDA的含量在萌發初期較高，但隨著時間的推移下降后期略有升高[29]。本試驗僅探討了酸、Pb、Cd單獨脅迫，3種耦合脅迫條件下寬葉雀稗種子的萌發機理及幼苗的生長規律還需進行進一步探討，并對其成年植株的抗逆解毒機理、富集規律、分子水平及細胞結構上的影響還有待進一步深入研究。

4 結論

高濃度Pb(≥500 mg·L-1)、Cd(≥50 mg·L-1)脅迫對寬葉雀稗種子萌發和幼苗生長具有顯著的抑制作用。寬葉雀稗種子及幼苗對酸脅迫表現出較強耐性，pH-3.5處理下仍可正常生長，綜合隸屬函數值分析表明，兩種弱酸(pH-4.5,pH-5.5)對寬葉雀稗種子萌發及幼苗生長有一定促進作用，其中pH-4.5處理效果最佳。

3種脅迫處理下CAT活性均呈先增后減趨勢，POD活性均表現為下降趨勢，SOD活性則相反。寬葉雀稗抗氧化酶系統在Pb、Cd及酸脅迫下應答機制不同，SOD、POD、CAT活性高低存在明顯的萌發時間差異和濃度效應。隨時間變化MDA含量多呈下降趨勢后略有上升，并隨各脅迫濃度的加強，各階段多呈先增后減趨勢。不同抗氧化酶相互協同配合作用可能是寬葉雀稗耐重金屬及酸脅迫的重要機制之一。