8份云南苜蓿屬優異種質資源對鋁脅迫的生理耐受響應研究

孫文君， 唐 敏， 任 健， 許 喆， 姜 娜， 馬向麗*， 畢玉芬*

(1. 云南農業大學動物科學技術學院， 云南 昆明650201； 2. 云南農業大學園林園藝學院， 云南 昆明650201)

鋁是地殼中含量最豐富的金屬元素，占地殼質量的7%左右[1]。在自然條件下主要以鋁硅酸鹽或氧化鋁形式存在[2]，生物可利用性很小；當土壤pH值低于5時，高活性鋁[Al3+、Al(OH)2+和Al(OH)3+]的含量增加，會對植物的生長發育造成較大威脅，鋁毒已成為酸性土壤中植物生長和發育最重要的限制因素[3-5]。自20世紀70年代起，植物耐鋁毒機制就倍受關注，現如今在酸性土壤中鋁毒對植物的影響已成為一個世界性的問題[6]。大量研究表明，植物根尖是對鋁積累和鋁毒最敏感的部位[7-8]。植物遭受鋁毒害時，根系最先受到毒害[9-11]。

苜蓿(Medicagosativa)是豆科苜蓿屬深根性多年生豆科牧草[12]，是世界上栽培最早、面積最大、經濟價值最高的牧草，也是改良土壤、保持水土的重要植物，有“牧草之王”的美稱[13]。苜蓿適宜生長在pH值為6.7～7.5的土壤環境中，土壤pH值低于6.7時，苜蓿產量會隨著pH值下降而迅速下降[14]；我國長江以南熱帶和亞熱帶地區，屬酸性土壤，紅黃壤土地占地面積很大，具有脫硅富鋁化的成土過程[15]，從而造成鋁毒害增強[12]。由于紫花苜蓿抗酸鋁能力較差，在我國南方的種植倍受限制[16]。如何提高苜蓿在酸性土壤中的產量，一直是國內外苜蓿工作者關注的重點。但是缺乏特異性抗酸鋁能力強的材料，且人們對苜蓿的抗酸鋁調節機制仍不完全清楚，導致抗酸鋁型苜蓿育種進展緩慢[17]。

云南有野生苜蓿資源4種，即天藍苜蓿(M.lupulinaL.)、毛苜蓿(M.edgeworthiiSirj. ex Hand. Mazz.)、南苜蓿(M.polymorphaL.)和紫花苜蓿(M.sativaL.)[18]。此外，還存在大量的逸生苜蓿材料。云南80年代開始試種苜蓿，但由于土壤和立體氣候等因素，至今尚未篩選出適宜大面積栽培和利用的品種。但期間卻保留少數個體逸生(逸散)于云南各地，經過長期的自然選擇和自然歸化，恢復到在沒有人工管理的野生狀態下，自己能年復一年繁衍生存下去，這些逸生苜蓿資源通常都是零星分布于草地上、草山草坡、農田邊或林緣，形成了一些具有特異耐酸鋁性的苜蓿種質資源，極具研究價值和育種前景[18]。然而，目前對云南野生和逸生苜蓿資料耐鋁性差異的報道較少。本研究探討了鋁脅迫下8份云南苜蓿屬種質材料根尖各項生理指標的變化，并采用隸屬函數分析法對8份苜蓿材料的耐鋁性進行了評價，以期為苜蓿在南方的推廣利用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

項目組前期在云南省各地進行了苜蓿屬資源調查，收集到云南野生和逸生苜蓿屬種質資源30份，保存在云南農業大學草業科學實習基地。通過栽種和生產性能評價，篩選出生長良好、且采集地pH值、生態環境差異較大的8份材料(表1)，進行了繁殖收種，用于耐鋁性鑒定。

表1 8份云南野生和逸生苜蓿材料的采集地點Table 1 The collection site of 8 wild and escaped alfalfa in Yunnan

1.2 實驗設計

在人工智能溫室中，采用12孔育苗盤珍珠巖育苗。待發芽后澆Hoagland完全營養液培育10 d后測株高、根長，并開始進行鋁脅迫處理(將營養液的pH調整為4.5，脅迫濃度梯度為0,50,100,200,500 μmol·L-1)。試驗期間每3 d更換一次營養液，脅迫處理時間10 d。

鋁脅迫處理后，測定各材料的根長、株高及各項生理指標。

1.3 測定方法

采用直尺分別測量供試材料脅迫處理前、后的株高和根長，并計算株高、根長抑制率，公式如下：

相對抑制率=(對照-脅迫處理)/對照×100%。

根系活力采用TTC比色法進行測定[19]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[17]測定；過氧化物酶(POD)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性參照孫群(2006)[20]的方法測定；耐鋁毒脅迫能力評價采用模糊數學中隸屬函數值的方法進行抗逆性綜合評定[21]：

隸屬函數值的換算方法：

A：R(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

B：R(Xij)=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

C：R(Xi)=xij/n

式中：R(Xij)表示i處理j指標的耐鋁隸屬函數值得，Xij表示i處理j指標的測定值，Xjmax和Xjmin分別表示各處理中指標的最大和最小的測定值，Xi為i處理的耐鋁隸屬函數值的平均值，n為指標數。由于根系活力、POD、SOD與耐鋁性呈正相關，計算耐鋁性隸屬函數值時用A式；MDA含量與耐鋁性呈負相關，計算時用B式。

1.4 數據分析

用Excel 2010和SPSS 19.0進行數據統計和作圖，并進行雙因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 鋁脅迫對苜蓿株高的影響

表2所示，鋁脅迫會抑制苜蓿株高生長，且供試材料的株高抑制率均隨著鋁脅迫濃度升高而增加，但不同材料在同一濃度下耐受性存在差異。各濃度鋁處理下，No.12的株高抑制率最低，均低于22%；在低濃度(<200 μmol·L-1)鋁處理時，株高抑制率最高的材料是No.5(>30%)；高濃度(≥200 μmol·L-1)鋁處理時，No.27的株高抑制率最高(>45%)。

表2 鋁脅迫下苜蓿株高抑制率的變化Table 2 The change of high inhibition rate of alfalfa plant under aluminum stress

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note：Different lowercase letter in the same column indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.2 鋁脅迫對苜蓿根系伸長的影響

由表3可知，濃度為50 μmol·L-1，No.5的根長抑制率最高，為33.94%，No.18的根長抑制率最低為13.24%；100 μmol·L-1鋁處理時，No.3的根長抑制率最高(52.92%)，抑制率最低的是No.12(22.85%)；濃度為200 μmol·L-1，鋁脅迫對No.5的根長抑制率最大，達到54.38%，No.21的抑制率最低(29.32%)；鋁處理濃度達到500 μmol·L-1時，根長抑制率最高的是No.3(68.89%)，抑制率最低材料是No.12(37.47%)，各材料間差異顯著(P<0.05)。其中，No.27和No.21在低脅迫濃度(≤200 μmol·L-1)時，根長抑制率變化平緩，高濃度(>200 μmol·L-1)鋁處理時根長抑制率顯著升高(P<0.05)，No.22、No.18和No.5的根長抑制率隨脅迫濃度增加而升高，在鋁脅迫為200～500 μmol·L-1濃度時，上升趨勢趨于平緩。比較4個鋁處理濃度下8份材料的根系相對伸長率，耐鋁性表現最好的為No.12，最差的為No.3、No.5。

表3 鋁脅迫對苜蓿相對根長抑制率的影響Table 3 The influence of aluminum stress on the relative root length inhibition rate of alfalfa

2.3 鋁脅迫對苜蓿根系活力變化的影響

如圖1所示，鋁處理會抑制苜蓿根系活力，8份苜蓿的根系活力均隨著鋁濃度升高而降低，但不同苜蓿材料在同一脅迫濃度下根系活力存在差異(P<0.05)。No.11、No.18、No.21和No.22根系活力變化趨勢較大，與對照組相比差異性最為顯著(P<0.05)；而No.3、No.5和No.27隨鋁脅迫濃度增加根系活力下降趨勢較為平緩。各材料的根系活力在500 μmol·L-1鋁處理時降至最低。

圖1 鋁對苜蓿根系活力的影響Fig.1 Changes of root vigor of alfalfa under aluminum stress注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同Note：Values followed by a different small letter are significant (P<0.05),The same as below

2.4 鋁脅迫對苜蓿根尖丙二醛含量的影響

MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，它的產生能加劇膜的損傷。由圖2可知，鋁脅迫下8份苜蓿材料根尖MDA含量有所增加，但同一材料在不同濃度下或不同材料在同一濃度下呈現不同變化趨勢。No.3根尖MDA含量隨著鋁脅迫濃度的增加顯著升高(P<0.05)；No.5、No.11和No.12根尖MDA含量呈先升高(50 μmol·L-1)后降低(100 μmol·L-1)再升高(200 μmol·L-1)后下降(500 μmol·L-1)；隨鋁處理濃度增加，No.18、No.21和No.22根尖丙二醛含量呈先升高后下降再升高趨勢，并在處理濃度增至500 μmol·L-1時達到最高；No.27的根尖丙二醛含量隨處理濃度升高至200 μmol·L-1達到最高后下降。

圖2 鋁對苜蓿根尖丙二醛含量的影響Fig.2 The effects of aluminum on MDA content of alfalfa root

2.5 鋁脅迫對紫花苜蓿根尖POD和SOD活性的影響

如圖3所示，鋁脅迫會降低苜蓿根尖POD活性，但不同材料對不同濃度脅迫下反應敏感程度不同。8份苜蓿材料的根尖POD活性都是隨著鋁脅迫濃度升高而顯著降低(P<0.05)。低濃度(<200 μmol·L-1)鋁處理，No.11的根尖POD活性最高，No.5最低；隨處理濃度(≥200 μmol·L-1)升高，No.18根尖POD活性最高，No.5最低；No.11、No.22和No.18，在處理濃度為50～100 μmol·L-1下根尖的POD活性變化不明顯，受200～500 μmol·L-1濃度處理后呈顯著下降趨勢(P<0.05)，說明No.12、No.11、No.22和No.18在高濃度脅迫下耐受性較低。

圖3 鋁對苜蓿根尖POD活性的影響Fig.3 Effects of aluminum on POD activity of alfalfa root tips

由圖4可見，隨著鋁脅迫濃度的增加供試苜蓿材料根尖SOD活性都呈下降趨勢，濃度為500 μmol·L-1時最低。各濃度鋁處理下，No.12的根尖SOD活性最高，No.3最低。其中，No.27、No.3和No.5材料較敏感，根尖SOD活性隨脅迫濃度升高顯著下降(P<0.05)；No.21、No.11和No.18在處理濃度為50～100 μmol·L-1時，SOD活性下降趨勢變化均不顯著(P>0.05)，而處理濃度升高至200～500 μmol·L-1時，這3份材料根尖SOD活性顯著降低，說明低濃度鋁脅迫對其根尖的SOD活性影響不大，且隨著處理濃度升高，這三份材料耐受性變差。

圖4 鋁對苜蓿根尖SOD活性的影響Fig.4 Effects of aluminum on SOD activity of alfalfa root tips

2.6 綜合評價

8份苜蓿材料的耐鋁性評判結果如表4-表7所示。綜合供試苜蓿材料在各處理濃度下的指標分析，No.12 和No.22材料均表現較好，其次為No.18，No.11，No.27，No.21，表現較差的材料為No.3，No.5。

表4 50 μmol·L-1處理下苜蓿耐鋁毒性綜合評判Table 4 Comprehensive evaluation of alfalfa resistance to 50 μmol·L-1 aluminium stress treatment

表5 100 μmol·L-1處理下苜蓿耐鋁毒性綜合評判Table 5 Comprehensive evaluation of alfalfa resistance to 100 μmol·L-1aluminium stress treatment

表6 200 μmol·L-1處理下苜蓿耐鋁毒性綜合評判Table 6 Comprehensive evaluation of alfalfa resistance to 200 μmol·L-1aluminium stress treatment

表7 500 μmol·L-1處理下苜蓿耐鋁毒性綜合評判Table 7 Comprehensive evaluation of alfalfa resistance to 500 μmol·L-1aluminium stress treatment

3 討論

本試驗研究了不同濃度鋁脅迫下，8份云南苜蓿材料幼苗的生長狀況及根尖生理生化指標變化。其中株高和根長是植物外在的形態指標，也是耐受性強弱最直觀的反映。本研究中，8份材料的株高及根長抑制率均隨處理濃度的升高呈上升趨勢，這與任曉燕等[22]對煙草植株高度受鋁脅迫影響顯著下降的研究及楊野等[23]和陳陽等[24]對鋁脅迫下植物根伸長的研究結果一致。且在本研究中，No.5、No.21和No.27的株高及根長抑制率呈顯著升高后變化趨于平緩。有研究[25]表明，植物在低濃度處理下其株高和根伸長受影響較大，隨著濃度的提高其變化量趨于平緩，主要原因是苜蓿材料的耐鋁性有一個閾值，在閾值范圍內苜蓿能進行自我調控和修復，超過閾值可能會使植物自我調節系統崩潰，影響植物的代謝水平，使植物生長發育變緩慢，進而影響植株及根系生長。同時可以看出，當植物面臨鋁脅迫時，能夠通過生理機能調節來減輕所受鋁脅迫的傷害。

根系活力的高低反映了植物根尖對養分的吸收和植物體內的代謝作用、營養狀況和產量水平，根系的生長發育狀況和根系的活力強弱將直接影響植物個體的生命活動。本研究中，8份苜蓿幼苗的根系活力隨著鋁處理濃度的增加而顯著降低，且不同材料在不同濃度下反應敏感程度不同(圖1)，這與李德華等[26]對鋁脅迫下蕎麥根系活力研究及劉鵬等[27]對大豆幼苗根系活力對鋁脅迫響應的研究結果一致。說明鋁對8份苜蓿幼苗的根尖有毒害作用，作用效果隨處理濃度的增加而升高。此外，李德華的研究還證明了根系活力(TTC)相對還原強度與植物的耐受鋁脅迫性質具有很強的一致性。植物細胞內的活性氧化物質累積會導致膜脂的過氧化并使得質膜透性的增高。丙二醛的大量積累，破壞膜脂的結構與功能，從而對植物造成傷害或死亡[28]。因此，可通過MDA含量了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統受損程度以及植物的抗逆性。楊野[23]等研究發現鋁處理可以顯著提高小麥根的MDA含量，與本試驗中苜蓿材料根尖的MDA含量變化一致，說明鋁脅迫造成了苜蓿根尖細胞膜脂的過氧化，并造成了根尖細胞膜和質膜的損傷。本研究發現在使用鋁毒脅迫后，特別是在鋁處理濃度為200 μmol·L-1時能使苜蓿根系中的MDA含量顯著升高(圖2)。部分苜蓿材料(No.5、No.11、No.12、No.18)根尖MDA含量先降低而后升高，羅亮等[29]的研究也表明：低濃度鋁處理時，茶葉的中的MDA含量較對照低，隨著鋁的升高，MDA含量上升，這說明適當濃度的鋁有利于細胞膜的穩定性。

SOD和POD作為防止植物細胞中活性氧簇產生的重要抗氧化酶[30]，二者活性的提高與維持是植物耐鋁脅迫的重要生理基礎[6,31]，POD可把SOD等產生的H2O2變成H2O,使活性氧維持在一個較低的水平上[7]。SOD在保護酶中起著尤為重要的作用，植物的衰老與SOD活性的下降呈正相關[32]。本實驗中受鋁毒脅迫處理的8份苜蓿材料根尖的兩種酶活性都隨脅迫強度的增大而呈下降趨勢，這與李智燕[33]等對鋁和酸脅迫下苜蓿根瘤菌的抗氧化酶系的研究和楊丹娜[1]等對苜蓿幼苗生長受酸鋁脅迫的影響研究結果一致,表明了其耐受的協同性,并共同組成了防御過氧化系統,抵抗環境不良條件對機體的破壞[6]。高濃度鋁(500 μmol·L-1)處理時，供試苜蓿幼苗根尖氧化酶活性下降至最低并造成苜蓿抗氧化酶系統破壞，這與在蕎麥[31]和蓼科植物[34]酸鋁脅迫研究中取得的結果一致。其中，No.21和No.5與對照組相比差異最顯著，變化趨勢最明顯，說明鋁脅迫對其根尖酶活性影響較大，而No.12根尖兩種酶活性下降趨勢較平緩，表明該材料耐受性較其他苜蓿材料好(圖3，圖4)。

4 結論

低濃度(0～100 μmol·L-1)鋁處理對云南野生和逸生苜蓿的形態指標的抑制作用較小，但苜蓿的根尖生理指標受脅迫影響變化顯著；隨鋁脅迫濃度增加(≥200 μmol·L-1)，苜蓿地上、地下部分生長明顯受到抑制，而生理指標變化趨于平緩；隨著鋁處理濃度的增加，苜蓿根尖受脅迫影響隨之增大，氧化酶活性呈逐級遞減的趨勢(P<0.05)。

根據隸屬函數評價結果，可將8份苜蓿材料分為耐鋁型(No.12，No.22)、中等耐鋁型(No.11，No.18，No.21，No.27)和(No.3，No.5)敏感型三種。No.12在不同濃度鋁脅迫處理下耐鋁性表現均較好，可結合后期的品比試驗表現，在南方酸性富鋁化土壤中推廣應用。