楊凌區紫花苜蓿葉枯病病原分離鑒定及其生物學特性

梁嘉俊， 李芳紅， 高鴻鵬， 趙文睿， 焦 鋒

(西北農林科技大學動物科技學院， 陜西 楊凌712100)

苜蓿(MedicagoSativa)是世界上種植面積最廣、最重要的一種多年生豆科牧草，其具有粗蛋白含量高，產量高的特點，有“牧草之王”之稱[1]。隨著苜蓿種植面積的進一步擴大，苜蓿病害逐漸成為影響苜蓿產量、品質、限制苜蓿廣泛應用的主要因素。據不完全統計，全世界每年因牧草病蟲害造成的牧草生產損失高達35%以上，其中由病害造成的苜蓿減產就在20%以上，病害嚴重情況下甚至會將整塊苜蓿地全部毀壞[2]。

立枯絲核菌是一種世界性廣泛傳播，屬無孢科(Agonomycetaceae)、絲核菌屬(Rhizoctonia)半知菌真菌，引起寄主植物葉枯和根腐等癥狀，被認為是最具破壞力的植物病原菌之一[3]。立枯絲核菌可引起根腐、莖腐、立枯及葉枯病害的植物包括馬鈴薯(Solanumtuberosum)[4]、水稻(Oryzasativa)[5]、玉米(Zeamays)、沙打旺(Astragalusadsurgen)[6]等。李克梅[7]在新疆苜蓿立枯絲核菌根腐病調查中發現，幾乎南北疆各苜蓿種植區都有此病害發生；郭玉霞[8]在豫中平原紫花苜蓿病原真菌調查中發現，春、夏、秋3個季節立枯絲核菌均有發生；陳雅君[9]在黑龍江紫花苜蓿種植區的8個地市縣病害調查，致病菌的優勢種為鐮刀菌、絲核菌。

由于立枯絲核菌不產生孢子，通常以菌絲融合反應對其進行融合群(anastomosis group，AG)的劃分[10]。但是使用融合群對立枯絲核菌進行鑒定需要大量標準菌株，多數研究者不具備如此條件，隨著分子生物學技術的迅速發展，逐步形成一套從基因水平上分析各微生物種之間親緣關系的分類鑒定技術與方法，且相較于傳統方法更為快速、準確[11]。核糖體DNA內轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)有非常豐富的遺傳變異，常用來研究真菌物種分類鑒定[12]。例如，淮穩霞[13]使用rDNA-ITS序列分析方法鑒定坪褐斑立枯絲核病菌的融合群類型并探討其系統發育關系；苗國輝[14]采用形態特征觀察、致病性測定及rDNA-ITS序列分析方法鑒定出天津、黑龍江兩地大白菜褐斑病病原菌為立枯絲核菌。

目前國內對紫花苜蓿立枯絲核菌病害的研究主要集中在新疆苜蓿根腐病方面[7,15-16]，陜西苜蓿種植區未見立枯絲核菌為致病菌的報道，本試驗對苜蓿葉枯病的病原菌進行鑒定，同時對其生物學特性進行研究，以期為該病害的發生、防治提供理論支持。

基于機械創新設計大賽的卓越工程師培養模式是一種全新工程師培養模式的探索，它基于大學生機械創新設計大賽這個學科競賽，其目的不僅僅局限于只是比賽，而是要以賽促教、以賽促學。在這種培養模式中，卓越工程師是培養的目的、方向，學科競賽是途徑與方法，兩者互為動力，缺一不可。概括起來有以下幾方面：

1 材料與方法

1.1 病樣采集及病原菌分離純化

2017年7月于陜西省楊凌區采集紫花苜蓿葉枯病樣本。按照常規組織分離法[17]分離培養，待菌絲長出后根據菌落特征分離純化，單一菌株再接入PDA培養基中擴大培養，并移入PDA斜面培養基4℃保存備用。

由于乙二醇機組的溫度控制存在較大的非線性、參數時變性和模型不確定性等因素，普通PID控制器難以獲得很好的控制效果，所以決定采用模糊PID控制來解決這個問題。

1.2 病菌形態及顯微觀察

假設在我國上市公司治理中，存在利益相關者甲和利益相關者乙，關于甲和乙誠信問題的囚徒困境博弈如圖3所示。

[論文集] 序號 作者.題名[C]//編著者.論文集名.出版地：出版者，出版年：起止頁碼.[學位論文] 序號 作者．題名[D].保存地點：保存單位，年份：起止頁碼.

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1.3 菌株基因組DNA提取及ITS序列PCR擴增

先在9.5 cm規格培養皿中放入兩層濾紙，0.5%吐溫-20處理后用脫脂棉包裹葉柄保濕，選取苜蓿植株上長勢良好無創傷的相鄰三個復葉為一個接種處理，每個培養皿中放入3片苜蓿復葉。用打孔器分別取若干3 mm菌餅，每個單葉上放1個菌餅，重復數為5，加入無菌水覆蓋培養皿底部。同時設空白無菌餅為對照，接種2 d后從葉片上取走菌餅，防止葉片細胞呼吸受阻死亡而使葉片變黃影響觀察，一周后觀察葉片發病情況并拍照統計。

1.4 病原菌ITS序列分析

測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST分析，然后使用MEGA7.0軟件進行序列間對比分析，構建分子系統樹，分析各菌株間同源性。

將菌株接于PDA平板于25℃黑暗培養一周后，觀察并記錄菌落特征；光學顯微鏡觀察并記錄菌絲結構、分支和隔膜的有無等顯微形態特征，根據真菌分類系統初步進行種類鑒定。

1.5 菌株致病性試驗

1.5.1離體葉片致病性測定 接種對象選用在溫室培養一月后無病的阿爾岡金紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Algonquin’)的葉片，接種前，先用自來水沖葉片表面，然后用0.5%的吐溫-20完全浸泡葉片5～10 s至葉片表面無氣泡。接種方法采用菌餅法接種(菌餅直徑約3 mm)，并分別設空白對照。

按照劉麗[18]的方法提取待測菌株DNA。采用真菌rDNA-ITS基因通用引物ITS1：5′-TCCGTA-GGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[19]。PCR擴增體系：2×Taq PCR MaterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL(對照加1 μL雙蒸水)，最后用雙蒸水補足至25 μL。ITS基因PCR擴增程序:94 ℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個循環；72℃延伸5 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測以后，委托西安擎科澤西生物科技有限公司進行序列測定，并將測得序列提交Genbank注冊登記。

1.5.2活體接種致病性測定 將阿爾岡金紫花苜蓿種子用70%乙醇表面消毒5 min，無菌水沖洗3次，晾干后播種于裝有滅菌基質土的直徑12 cm塑料花盆中，每盆播種15粒種子，置于25℃、相對濕度60%、光照16 h、黑暗8 h人工氣候箱中培養。

用Mega7.0 軟件進行多序列比對，采用K2模型，分別用鄰接法(NJ)構建rDNA-ITS序列的系統進化樹(圖4)。

1.6 病原菌的生物學特性

1.6.1不同光照處理對病原菌菌絲生長的影響 將供試菌株接種于PDA平板培養基活化培養后，選取單菌落用以滅菌的打孔器從菌落邊緣切取4 mm直徑的菌餅，接種至新鮮的PDA平板中央，各處理重復3個培養皿。并分別放置于全黑暗、全光照、12 h光暗交替三種光照條件下，25 ℃恒溫培養3 d后，用游標卡尺采用十字交叉法測量菌落的生長直徑。

1.6.2不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 以Czapek培養基[17]作為基本培養基，并分別用相同質量的果糖、葡萄糖、淀粉代替培養液中的蔗糖作為不同碳源，最后在每升培養液中加入17 g瓊脂配制成含不同碳源的培養基，并以不加碳源、補加2 g·L-1NaCl的培養基作為對照；將4 mm直徑的病原菌菌餅接入各培養基平板中央，各處理重復3個培養皿。25 ℃恒溫培養3 d，按照1.6.1方法測定。

1.6.3不同氮源對病原菌菌絲生長影響 以Czapek培養基作為基本培養基，分別以相同質量的硝酸鉀、硝酸銨、硝酸鈉和牛肉膏代替培養基中的NaNO3，同時以不加氮源、補加2 g·L-1NaCl的培養基作為對照；取直徑為4 mm菌餅置于各培養基中央，各處理重復3個培養皿。置于25 ℃恒溫培養3 d后，按照1.6.1方法測定。

1.6.4不同pH值對病原菌菌絲生長的影響 以濃度為0.1 M的NaOH與0.1 M的HCl將加熱融解完全后的PDA培養基的pH值分別調至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0共5個梯度，高溫滅菌后倒入培養皿，并將直徑為4 mm的菌餅接入不同pH值的PDA平板中央，各處理重復3個培養皿。25 ℃恒溫培養3 d后，按照1.6.1方法測定。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿葉枯病癥狀

該病原真菌生長迅速，在PDA培養基上25℃ 培養3天可長滿整個培養皿,菌落呈白色至淺褐色平鋪于培養基上。菌絲絨毛狀,呈放射分布。菌落中央產生白色至褐色菌核，背面呈深褐色(圖2A，B)。顯微形態：菌絲體較粗大，初為無色，后呈淡黃褐色至褐色，直徑7～10 μm，分支呈直角，分支處縊縮，附近形成隔膜(圖2 C，D)。

圖1 紫花苜蓿葉枯病發病癥狀Fig.1 The symptoms of Medicago sativa leaf blight disease

2.2 病原菌菌落及顯微鏡照片

發病初期葉面出現形狀不規則的褐色病斑，病斑邊緣葉面枯黃，逐漸擴大，病組織呈水漬狀崩解腐爛。死亡組織呈深褐色至黑色，葉面干枯皺縮(圖1A，B)。

測序結果分析表明其序列總長度為573 bp，G+C含量為55.67%，將序列上傳至NCBI數據庫，得GenBank登錄號為：MH014991，病原菌序列與GenBank中已有的序列進行核酸BLAST比對分析，得到與Genebank中已有序列同源性較高的菌種信息，選取立枯絲核菌不同融合群的模式菌株用于系統發育分析(表1)。

圖2 紫花苜蓿葉枯病病原形態特征Fig.2 The pathogen morphological characteristics of alfalfa leaf blight disease

2.3 分子生物學鑒定

將所提取出的病原菌DNA作為模板，用真菌ITS通用引物ITS1/ITS4做PCR擴增，產物經5 μL點樣電泳后進行EB染色，在紫外凝膠成像系統下拍照如圖，條帶單一較亮，且無非特異性擴增條帶，分子量在500～750 bp之間(圖3)。

根據以上對病根癥狀及病原菌形態學的觀察，參考《真菌分類鑒定手冊》[20]，鑒定病原菌屬半知菌亞門，無孢目，絲核菌屬(Rhizoctonia.)。

接種液配制：接種菌株于PDA平板兩周后，刮取菌絲，使用0.5%吐溫-20無菌水配制成0.01 g·ml-1接種液。選取培養30d后長勢相同的苜蓿植株，使用噴霧器將接種液平均噴施于健康苜蓿植株上，對照組接種0.5%吐溫-20無菌水，之后正常溫室管理，2周后觀察發病狀況并記錄拍照。

圖3 PCR擴增產物電泳圖Fig.3 The agarose gel electrophoresis of DNA products amplified by PCRM：DL2000 DNA marker；1：樣本泳道Sample；CK：陰性對照Negative control

分析rDNA-ITS序列構建系統進化樹，分支上側數字為大于50%的Bootstrap檢驗值(1000次重復)，結果表明：在遺傳距離為0.05，Bootstrap為1 000次檢驗時，病原菌rDNA-ITS序列seq與R.solaniAG1，IA(AB000017.1)序列的置信度為98，說明本試驗研究的苜蓿葉枯病病原菌為立枯絲核菌(R.solani)AG1，IA融合群。

表1 用于系統發育樹分析的相關菌株Table1 Related strains usedn phylogenetic analysis

圖4 基于rDNA-ITS序列的NJ樹Fig.4 The NJ tree of rDNA-ITS sequence

2.4 致病性測定

2.4.1病原菌離體葉片接種 接種2 d后開始出現明顯癥狀(圖5A)，接種葉片上具有不規則的褐色病斑，斑點周圍有少許退綠現象，接種一周后(圖5B，C)，病斑大面積存在于葉面。發病癥狀與田間發病癥狀相似，而對照組沒有出現任何發病現象。通過統計菌餅接種法接種的27片復葉，浸染成功葉片數為17，發病率為62.96%。

2.4.2活體接種法 采用孢子懸浮液對健康的紫花苜蓿植株進行活體接種2周后進行病情統計：根部的側根褐化、腐爛，部分根毛脫落(圖6A)，葉部出現大小不等的深褐色病斑，病斑邊緣枯黃，部分葉片直接褪綠變黃(圖6B)。發病癥狀于田間采樣的病株癥狀基本相同，本試驗所分離的菌株亦可引起苜蓿植株根部病變，而對照組則沒有任何發病現象(圖6C)。

綜上對病原菌致病性的試驗結果，并分別對離體葉片接種和活體接種處理組發病葉片進行病原菌分離、純化培養，得到與原接種所用相同病原菌，分離率為100%。根據科赫氏法則，可說明本試驗研究的病原菌是具有致病性的立枯絲核菌(R.solani)。

2.5 病原真菌的生物學特性研究

2.5.1不同光照條件對病原真菌菌絲生長的影響 不同光照條件下對立枯絲核菌的菌絲生長稍有差異,黑暗條件下菌絲生長優于其他條件，但與光暗交替條件下菌絲的生長差異不顯著(表2)。

圖5 菌餅法離體葉片接種結果Fig.5 The results of inoculated with fungal block

圖6 紫花苜蓿活體接種后發病情況Fig.6 The incidence of Alfalfa after inoculation in vivo

表2 光照對病原菌生長的影響Table 2 The effect of light on the growth of pathogenic

注：表中數據為平均數±標準差。同列數據后相同字母表示經LSD法檢驗P=0.05水平差異不顯著

Note:Values represent the means±SD of three replicates. The same letters in the same row are not significant different according to the least significant difference test (P=0.05)

2.5.2不同pH對病原真菌菌絲生長的影響 pH對于立枯絲核菌的菌絲生長無明顯影響，pH在6.0～9.0時，菌株菌絲生長均表現良好，無顯著差異(P<0.05)，但在pH值為7時，菌絲生長最優(圖7)。

圖7 pH對病原菌生長的影響Fig.7 The effect of pH on the growth of the pathogen

2.5.3不同碳源對病原真菌菌絲生長的影響 供試病原菌對供試碳源的利用情況存在一定的差異，但在不同碳源及無碳對照組CK中均能生長。立枯絲核菌菌絲在含可溶性淀粉的培養基上生長最好，在含果糖的培養基中生長最差，且差異性顯著。在其他3種不同碳源培養基中，立枯絲核菌菌絲的生長差異明顯，表現為蔗糖>葡萄糖>果糖。在無碳對照CK培養基上，菌絲生長最慢且極其稀疏，不利于病原菌的生長(表4)。

基于雙語平行語料庫的翻譯研究在國內取得了一些成果(柯飛，2003，2005；秦洪武，2005，2009；徐欣，2010)，為后人研究提供了一套較為成熟的研究思路和方法。本研究通過運用自建的漢英多譯本平行語料庫對同一篇中文小說的五位不同英譯者的翻譯文本進行對比分析，定量反映不同譯者文本的詞匯密度/豐富度、用詞偏好、句法特征等，揭示譯文的獨特性和共同特征。

表4 不同碳源對病原菌生長的影響Table 4 The effect of different C-source on growth of pathogenic

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note:Different letters in same row indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.5.3不同氮源對病原真菌菌絲生長的影響 立枯絲核菌在不同氮源培養基中菌絲生長具有顯著差異(P<0.05)。立枯絲核菌在不同氮源的培養基及無氮對照培養基(CK)中均能生長并產生氣生菌絲，但不添加氮源時菌絲十分稀疏。相比之下，氮源為硝酸鉀最利于立枯絲核菌的生長，其次是硝酸鈉與牛肉膏，而硝酸銨對立枯絲核菌生長的促進作用最小，但這四種氮源對于立枯絲核菌在培養基上的生長特性均沒有特別明顯的影響(表5)。

3 討論

通過對陜西省楊凌區紫花苜蓿葉枯病田間調查、病樣采集、病原菌室內分離鑒定、致病性測定，確定了導致楊凌地區紫花苜蓿葉枯病的致病菌為立枯絲核菌，通過rDNA-ITS序列分析確定了紫花苜蓿葉枯病病原菌為AG1，IA融合群，GenBank登錄號為：MH014991。

表5 不同氮源對病原菌生長的影響Table 5 The effect of different C-source on growth of the pathogen

有研究指出立枯絲核菌中AG1類群可引起多種植物地上部分及葉脈的枯萎；AG2引起十字花科作物的根腐；AG4引起豆科作物的根腐[21]。在以往的研究中，立枯絲核菌主要是引起紫花苜蓿根腐病的重要病原菌[7-9,15]，李克梅[7]指出新疆苜蓿立枯絲核菌菌絲融合群有AG1，AG2，AG4，AG5 4種類型，其中AG2和AG4是優勢融合群，與本試驗從葉部病樣分離鑒定的立枯絲核菌菌絲融合群AG1,IA有所差異，雖然在活體致病性測定中，本試驗分離的菌株也表現對苜蓿根部侵染的能力(圖6A)。立枯絲核菌作為一種寄主范圍較為廣泛的致病菌，在不同地域情況下，對相同寄主寄生的立枯絲核菌類群表現出一定的地域特異性。伍恩宇[22]報道陜西周至馬鈴薯立枯絲核菌菌絲融合群有AG-4，AG-5兩種類型；陜西草坪草立枯絲核菌菌絲融合群有AG1-1A，AF1-1B，AG2-2ⅢB，AG2-2Ⅳ，AG5 5種類型[23]。陜西苜蓿立枯絲核菌菌絲融合群與陜西其他植物各有差異，說明菌絲融合群對寄主植物種類具有一定的選擇性。

苜蓿葉枯病菌在pH值為5.0～9.0的范圍內生長良好，以pH值為7.0最適合生長，說明酸性環境下不利于該菌生長，這與臺蓮梅[24]的研究馬鈴薯立枯絲核菌最適pH值為7.0的結果一致，與路小琴[25]報道馬鈴薯立枯絲核菌在pH值為6.0的固體培養基上生長最快有所差異；黑暗培養對苜蓿葉枯病菌菌絲生長有促進作用，與劉志恒[26]研究發現黑暗條件有利于白菜葉腐病病原菌(Rhizoctoniasolani)菌絲生長相同；在不同碳源、氮源培養基上生長情況差異明顯，其中可溶性淀粉和硝酸鉀對菌絲生長有顯著的促進作用，與白菜葉腐病病原菌[26]、石竹莖腐病病原菌[27]最適碳源相似，但與上述兩種立枯絲核菌最適氮源有所差異，這可能是分離的菌屬于不同的菌絲融合群，生物學特性有一定的差異。根據病菌不喜酸性的特點，可采用石膏或酸性肥料等方法調節土壤酸堿度，抑制土壤中病菌的生長。

4 結論

本試驗較為系統的分析了陜西省苜蓿葉枯病致病菌及其生物學特性，與以往報道立枯絲核菌引起苜蓿根腐病[7-9]不同，本試驗明確了立枯絲核菌亦是苜蓿葉枯病致病菌，同時也是陜西省首次報道立枯絲核菌引起苜蓿葉枯病。苜蓿葉枯病原菌生物學特性研究發現該菌最適pH值為7.0；黑暗條件下有利于該菌生長；對碳源的利用效果中以可溶性淀粉最好，而對果糖利用效果最差；最適氮源為硝酸鉀，而對硝酸銨利用效果最差。