DNAJA1過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞的鑒定

易禮智 王琴 程征宇（通訊作者）

（樂山市人民醫(yī)院消化內(nèi)科 四川 樂山 614000）

近年來，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，結(jié)直腸癌的病死率有所下降，但它仍是人類最常見的惡性腫瘤之一，且它的發(fā)病率有逐年上升的趨勢[1]。DNAJA1是熱休克蛋白40家族（也稱DNAJ家族）成員之一，主要負(fù)責(zé)如展開錯誤折疊的蛋白質(zhì)、折疊多肽鏈、參與多肽的跨膜運(yùn)輸、組裝及拆卸蛋白質(zhì)復(fù)合物并控制、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生成等細(xì)胞生理活動[2-3]。近年來，DNAJA1越來越多地出現(xiàn)在腫瘤相關(guān)領(lǐng)域的研究報道中。在敲除DNAJA1的小鼠C6惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞敲除DNAJA1后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)[4]。另外，DNAJA1可以增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療抵抗性[5]。但目前，DNAJA1在結(jié)直腸癌中的作用尚無文獻(xiàn)報道。

1.材料與方法

1.1 材料

Lipofectamine2000、Trlzol購自life公司；PCR試劑盒、T4 DNA連接酶和DNA Marker均購自Promega公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提取試劑盒均購自QIA InC公司；限制性內(nèi)切酶KpnI、Xhol購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增目的基因 DNAJA1（NM_001314039.1）的擴(kuò)增編碼區(qū)序列（CDS區(qū)）總共723個堿基。利用primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計。以人正常結(jié)直腸cDNA為模板對目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，62℃退火40s，72℃延伸90s，完成35個循環(huán)后再延伸5min。擴(kuò)增完成后，分別取5ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖（1.5%）凝膠電泳鑒定。

1.2.2 瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞 用含10%胎牛血清的RPMI.1640培養(yǎng)基培養(yǎng)6株結(jié)直腸癌細(xì)胞并放置在37℃、5%的C02培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前l(fā)天將HT29和HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)種至6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合到60%～70%時，以脂質(zhì)體（Lip0fectamineTM2000）為載體分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1-DNAJA1和空白質(zhì)粒pEGFP-C1，48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行Real-time PCR及Western-blot檢測。

1.2.3 Real-time PCR收集細(xì)胞，按Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑說明書分別提取RNA及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。DNAJA1上游引物 5’CCTTCAT TTGGATT CTTATCAGG3’；下游引物5’GAGCCAAAACCACCACCTGC3’；GAPDH 上游：5'-GTCCACCACCCTGTTG CTGTA-3'；下游：5'-CTTCAACAGCGACACCCACTC-3'。PCR反應(yīng)體系10ul，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，95℃變性10s，60℃退火40s，72℃延伸30s，共40個循環(huán)。根據(jù)PCR反應(yīng)曲線得到各樣品目的基因和看家基因的Ct值，計算2-ΔΔCt值進(jìn)行相對定量。

1.2.4 Western blot檢測：細(xì)胞總蛋白提取及濃度測定按說明書操作。蛋白變性、制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉1h，用兔抗人DNAJA1單克隆抗體（1∶300）、鼠抗人GAPDH單克隆抗體（1∶1000），4℃過夜孵育，PBST溶液洗膜三次，每次10分鐘，羊抗鼠、兔IgG二抗（1∶10000），室溫孵育1h，發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究的實驗數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（δ±s）表示，各項指標(biāo)的兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本的檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

圖1 DNAJA1 在6株結(jié)直腸癌細(xì)胞中的mRNA（圖A）和蛋白水平檢測（圖B）

圖2 DNAJA1過表達(dá)載體的構(gòu)建（圖A）及在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和HT29中的mRNA（圖B）和蛋白水平檢測（圖C）

2.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞株中DNAJA1的含量

Real-time PCR 及 Western blot檢測6株結(jié)直腸癌細(xì)胞：HCT-116、HT-29、LoVo、SW620、SW480、174T 中 DNAJA1 mRNA及蛋白水平。結(jié)果顯示：DNAJA1在HCT116及HT29細(xì)胞中的mRNA及蛋白水平較低，在LoVo和SW620中的含量較高（見圖1）。故選擇HCT116和HT29細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染DNAJA1基因過表達(dá)重組質(zhì)粒。

2.2 DNAJA1過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以重組質(zhì)粒為DNA模板，進(jìn)行DNAJA1 PCR 擴(kuò)增實驗、凝膠電泳鑒定（圖2A），為保證合成的DNAJA1基因編碼區(qū)序列定向克隆至pEGFP-C1表達(dá)載體，進(jìn)行DNA測序鑒定及BLAST比對，顯示插入的堿基序列片段與目的基因完全一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。同時，我們將DNAJA1 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HT29和HCT116細(xì)胞。Real-time PCR及 Western blott 結(jié)果顯示，HT29和HCT116細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染DNAJA1過表達(dá)質(zhì)粒后，DNAJA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著增高（見圖2B和2C）。以上結(jié)果顯示，DNAJA1過表達(dá)質(zhì)粒在結(jié)直腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染及表達(dá)成功。

3.討論

DNAJA1是HSP40蛋白家族成員之一，在與腫瘤相關(guān)的研究中，DNAJA1參與了包括蛋白降解[6]、侵襲[4]和凋亡[7]等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞生理活動。在胸膜惡性間皮瘤中，DNAJA1的低表達(dá)與病人在術(shù)后短期內(nèi)復(fù)發(fā)相關(guān)[8]。但它在結(jié)直腸癌中功能還沒有進(jìn)行深入的研究。

本篇文章中，我們首先檢測了DNAJA1在6株結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)在高轉(zhuǎn)移和侵襲的SW620和LoVo細(xì)胞中DNAJA1表達(dá)較高，而在低轉(zhuǎn)移的HCT116和HT29中，表達(dá)較低。這可能表明DNAJA1 在結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中有重要作用。但這與之前報道的在惡性膠質(zhì)瘤中敲除DNAJA1后促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲的結(jié)論截然不同[4]。因此為了進(jìn)一步研究DNAJA1在結(jié)直腸癌中的作用及分子機(jī)制，接下來，我們以人正常的結(jié)直腸cDNA為模板對DNAJA1因進(jìn)行擴(kuò)增。DNAJA1基因開放閱讀框全長723bp，我們利用primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切、膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆以及反復(fù)驗證，成功將全長DNAJA1基因克隆至過表達(dá)載體pEGFP-C1中，并借助脂質(zhì)體將其瞬時轉(zhuǎn)染至HCT116和HT29細(xì)胞，經(jīng)Realtime和Westen-blot檢測表明pEGFP-C1-DNAJA1過表達(dá)載體構(gòu)建成功，并在SW480細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)染率較高，這為我們下一步進(jìn)行更深入的研究創(chuàng)造了條件。