人臍帶Wharton’s Jelly來源間充質(zhì)干細胞和人牙周膜干細胞復合PHBHHx、 PHBV支架成骨分化能力的體外研究

黃銀莉 周洪 盧曉云 蘇曉霞 鐘天宇

口腔頜面部骨組織工程技術(shù)的研究主要集中在種子細胞、支架材料和調(diào)控因素等方面。hPDLSCs因其來源受限、細胞產(chǎn)量較低、存在混雜細胞等缺點，尋找新的替代種子細胞成為研究熱點。hUCWJMSCs因其在細胞增殖、多向分化、免疫特性以及旁分泌等方面更具優(yōu)勢，引起廣泛的關(guān)注[1]；其成骨能力已被許多學者證實并應用于骨組織工程[2-3]。本課題組前期已在體外對2 種干細胞成骨分化能力進行研究，但結(jié)合支架材料的成骨分化能力的研究尚缺乏。PHBV、PHBHHx是PHAs家族中研究比較多的成員，因其具有良好的無毒性、生物相容性、可降解性目前廣泛應用于再生醫(yī)學和組織工程技術(shù)中。本實驗通過體外hUCWJMSCs、hPDLSCs復合PHBV、PHBHHx支架，研究hUCWJMSCs成為牙周骨組織工程種子細胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

PHBHHx、PHBV支架(西安交通大學生命科學學院實驗中心)DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶(Gibco,美國)；L-抗壞血酸2-磷酸鹽、地塞米松、β-甘油磷酸鈉(Sigma，美國)；ALP半定量試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)；茜素紅、倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)；熒光顯微鏡(Leica DM4000B，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞與支架粘附率測定 支架預備：將PHBHHx和PHBV膜裁剪成1 cm2大小，75%酒精浸泡過夜。然后置于無菌的24 孔培養(yǎng)板中，超凈臺內(nèi)紫外線正反面各照射1 h，每孔加入1 ml細胞培養(yǎng)液，直到培養(yǎng)液全部滲透進支架中，然后PBS 清洗支架3 次，自然晾干，備用。

取24 孔培養(yǎng)板，在孔內(nèi)植入備用的無菌PHBHHx和PHBV支架，取生長良好的P3代hUCWJMSCs、hPDLSCs細胞，調(diào)整細胞濃度為3×105/孔接種到制備好的支架上，置于37 ℃、5% CO2條件下進行培養(yǎng)。分別在4、8、12、24 h后取出支架復合體，PBS液沖洗，去除未粘附細胞、消化收集并計數(shù)，得出流失的細胞數(shù)；

再將細胞支架復合體于新的24孔板培養(yǎng)24 h后，將其輕輕振蕩并收集培養(yǎng)液中細胞并計數(shù)，為未粘附細胞數(shù)。每個樣本3 個復孔。

細胞粘附率=(接種細胞數(shù)-流失細胞數(shù)-未粘附細胞數(shù))/(接種細胞數(shù)-流失細胞數(shù))×100%

1.2.2 MTT法檢測細胞與支架結(jié)合后細胞增殖情況

取PHBHHx和PHBV 2 種膜，每組平行對照3 個，每孔置1 塊材料，置于24 孔培養(yǎng)板上預濕，不加膜組作為陰性對照；將hUCWJMSCs和hPDLSCs 2 種細胞分別接種于材料及陰性對照孔中，每孔加0.5 ml培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，酶標儀上測定各孔光吸收值，波長為570 nm，收集數(shù)據(jù)并進行分析。

1.2.3 細胞與支架結(jié)合后成骨分化能力測定

1.2.3.1 細胞接種與誘導 將hUCWJMSCs和hPDLSCs接種于放置支架的 24 孔板中，接種密度為每個孔103個細胞，加入普通培養(yǎng)基培養(yǎng)；當細胞生長達到 70%～80%的時候，將培養(yǎng)基換為成骨分化培養(yǎng)液，成骨誘導培養(yǎng)液：DMDM/F12培養(yǎng)基，100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素，0.25 μg/ml兩性霉素B、終濃度10%FBS，10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油及50 μmol /L的L-抗壞血酸-2-磷酸。3 d換1 次培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)21 d；用普通培養(yǎng)基同時培養(yǎng)細胞，其它培養(yǎng)條件與成骨分化組相同，做為陰性對照。

1.2.3.2 堿性磷酸酶(ALP)半定量檢測 hUCWJMSCs和hPDLSCs分別和PHBHHx、PHBV膜接種于24 孔板中，細胞總量為103個，進行成骨誘導，分別在培養(yǎng)1、3、5、7、14、21 d收集細胞進行ALP定量檢測。檢測步驟按ALP半定量試劑盒進行。

1.2.3.3 茜素紅染色 hUCWJMSCs和hPDLSCs分別和PHBHHx、PHBV膜接種于24 孔板中，細胞總量為103個，進行成骨誘導，連續(xù)誘導21 d。對照組為細胞和支架結(jié)合常規(guī)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，21 d后分別進行茜素紅染色。

1.2.4 細胞與支架結(jié)合后掃描電鏡觀察 無菌條件下，收集生長良好的hUCWJMSCs和hPDLSCs, 胰酶消化、離心,調(diào)整細胞數(shù)量為1.0×105/ml，分別均勻接種在預先處理置于24 孔板的2 種膜上，形成細胞材料復合體，將其在37 ℃ 、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1 d后將培養(yǎng)基換為成骨誘導劑繼續(xù)培養(yǎng)，21 d后掃描電鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 hUCWJMSCs、hPDLSCs與PHBHHx、 PHBV支架結(jié)合后細胞粘附率測定

hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBHHx、PHBV接種后，2 種細胞在PHBV膜上的粘附率高于其他各組，其中hUCWJMSCs接種于PHBV膜的粘附率最高；而hPDLSCs與PHBHHx粘附率最低。從數(shù)據(jù)可以看出，隨著接種時間的增長，粘附率成遞增趨勢，24 h時各組粘附率均最大(表 1)。

2.2 MTT法測定hUCWJMSCs、hPDLSCs與PHBHHx、PHBV支架結(jié)合后細胞增殖能力

結(jié)果表明hUCWJMSCs在PHBHHx、PHBV膜上增殖明顯增快(P<0.05)，同時在PHBV膜上A值明顯高于PHBHHx(P<0.05)；hPDLSCs在PHBV膜上增殖明顯增快(P<0.05)，而在PHBHHx增殖不明顯(P>0.05)(圖 1)。

2.3 hUCWJMSCs、hPDLSCs與PHBHHx、PHBV支架結(jié)合后細胞成骨分化能力測定

2.3.1 ALP半定量檢測 hUCWJMSCs和hPDLSCs分別與PHBHHx、PHBV支架結(jié)合后進行成骨誘導，ALP檢測成骨誘導情況。結(jié)果表明hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBV膜ALP的表達明顯高于與PHBHHx膜；hUCWJMSCs與兩種膜的ALP表達高于hPDLSCs(圖 2)。

2.3.2 茜素紅染色 hUCWJMSCs和hPDLSCs分別于PHBHHx、PHBV支架結(jié)合成骨誘導21 d后進行茜素紅染色。對照組染色均未見紅色顆粒形成；誘導組中hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBV支架組可明顯的紅色被染鈣化基質(zhì)，hUCWJMSCs與PHBHHx支架可見到紅色被染基質(zhì)，hPDLSCs與PHBHHx支架被染紅色鈣化基質(zhì)較少(圖 3)。

表 1 hUCWJMSCs、hPDLSCs分別接種于PHBHHx、PHBV的粘附率

圖 1 hUCWJMSCs、hPDLSCs分別與接種于PHBHHx、PHBV后第3天的增殖情況

圖 2 hUCWJMSCs、hPDLSCs分別接種于PHBHHx、PHBV成骨誘導后ALP活性

圖 3 hUCWJMSCs、hPDLSCs分別接種于PHBHHx、PHBV成骨誘導后的礦化檢測(茜素紅染色, ×30)

2.3.3 hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBHHx、 PHBV支架結(jié)合后掃描電鏡觀察 hUCWJMSCs和hPDLSCs分別于PHBHHx、 PHBV支架結(jié)合成骨誘導21 d后進行掃描電鏡。電鏡下PHBHHx、 PHBV膜表面較粗糙，其中PHBHHx為球狀突起，中間形成有孔結(jié)構(gòu)；PHBV膜含有大量的有孔結(jié)構(gòu)且彼此相通。成骨誘導后，誘導組中hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBV支架組可見明顯的細胞附著，在細胞周圍可見大量鈣結(jié)節(jié)和礦化基質(zhì)形成； hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBHHx支架細胞附著較少，形成的礦化基質(zhì)也較少(圖 4)。

圖 4 hUCWJMSCs、hPDLSCs分別接種于PHBHHx、PHBV成骨誘導后表面形態(tài)觀察(SEM, ×2 000)

3 討 論

牙周骨組織再生是臨床治療和研究的難點，快速發(fā)展的骨組織工程為牙周骨再生提出了新的思路[4-5]。大量的研究集中在種子細胞的選擇、支架材料的生物性能及相關(guān)的調(diào)控因素的研究[6-7]。關(guān)于hUCWJMSCs應用于牙周組織修復等方面的研究也成為熱點[8]，其和hPDLSCs的成骨分化能力分別被諸多實驗證明[9-10]，同時也分別比較與其他成體干細胞成骨分化能力[11-12]，但是關(guān)于hUCWJMSCs和hPDLSCs 2 種干細胞成骨分化能力的研究尚缺乏，與支架材料結(jié)合后的成骨能力方面的研究也較少。

種子細胞與支架結(jié)合后的良好的生物相容性及成骨分化能力是應用于骨組織工程的前提。Wang等[13]將hPDLSCs與牙骨質(zhì)來源間充質(zhì)干細胞分別與靜電紡絲PHBV共聚體支架結(jié)合，結(jié)果顯示支架復合體表現(xiàn)出良好的細胞黏附率和增殖能力。研究表明hUCWJMSCs與PHBHHx和 PHBVHHx支架具有很好的生物相容性，能夠促進hUCWJMSCs的生長和支持hUCWJMSCs向成骨細胞的分化。在本課題組前期的研究中，體外比較了2 種干細胞的成骨分化能力，但未復合支架材料。PHBV、PHBHHx是PHAs家族中研究比較多的成員[14]，因其具有良好的生物相容性、可降解性以及無毒性目前廣泛應用于組織工程技術(shù)中[15-16]。本實驗通過將hUCWJMSCs和hPDLSCs與支架材料PHBV、PHBHHx結(jié)合并進行成骨誘導，探討哪種支架復合體更適合于牙周骨組織工程研究。

本實驗結(jié)果顯示隨著接種時間的增加，細胞的粘附率增加，此結(jié)果提示在研究過程中細胞至少接種24 h后方可進行其他方面研究。hUCWJMSCs和hPDLSCs在PHBV膜上A值明顯高于對照組(P<0.05)，及PHBHHx組(P<0.05)，表明hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBV膜有良好的生物相容性，這與其他研究得出類似的結(jié)論[17]。掃描電鏡觀察到PHBV相對于PHBHHx膜具有更大的孔隙率及連通情況，為細胞黏附提供了良好的空間，這也就解釋了2 種細胞與其生物相容性更好的原因。研究顯示在保證材料機械強度的情況下應盡可能的增加孔隙率及連通率以利于細胞的營養(yǎng)供應[7]。目前多數(shù)學者認為材料孔徑的大小應該在220 μm左右以適應人體自身骨單位同時保證相關(guān)成骨物質(zhì)ALP及骨鈣素等的表達，故成骨誘導后于PHBV支架可看到大量細胞外基質(zhì)的分泌。

本實驗對細胞支架復合體成骨誘導后ALP檢測、茜素紅結(jié)果說明2 種干細胞與PHBV膜結(jié)合后在成骨誘導劑的作用下均可向成骨方向分化且優(yōu)于PHBHHx，同時hUCWJMSCs較hPDLSCs在PHBV膜上表現(xiàn)除更強的成骨能力。Cheng等[18]將骨髓基質(zhì)干細胞與PHBV膜結(jié)合植入備犬脛骨骨缺損模型，結(jié)果顯示PHBV膜無明顯毒性，術(shù)后12 周骨缺損基本被新骨填充，證明PHBV為一種較理想的引導骨組織再生的天然材料。hUCWJMSCs與PHBV支架復合物可作為牙周骨組織工程的種子細胞和支架材料進行進一步研究。

綜上，hUCWJMSCs與PHBV支架的生物相容性和成骨分化能力較hPDLSCs更有優(yōu)勢，同時2 種干細胞與PHBV較PHBHHx具有更好的生物相容性和成骨分化能力，說明hUCWJMSCs與支架材料PHBV在牙周骨組織工程應用方面具有明顯的優(yōu)勢。同時在后期的實驗中，需通過體內(nèi)實驗進一步研究此細胞支架復合體體內(nèi)成骨情況以及臨床應用的免疫特性和安全性。