口腔扁平苔蘚病損中Th17/Treg平衡及意義

賈沛茹 劉芳 柳汀 蔡揚

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)是一種常見的口腔黏膜慢性炎性疾病，典型病理表現為上皮固有層有以T細胞為主的大量淋巴細胞呈密集帶狀浸潤[1]。 越來越多的研究支持細胞免疫異常在OLP病因機制中的作用[2]。據報道Th17和Treg細胞均參與了OLP的局部免疫反應[3-6]。本研究采用免疫組織化學技術、qPCR技術分別檢測IL-17、FOXP3、TGF-β1的表達和分布以及IL-17、RORc和FOXP3mRNA的表達情況，探討Th17/Treg平衡在OLP局部病損中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

口腔黏膜組織標本選自2010～2015 年就診于貴州醫科大學附屬醫院口腔黏膜專科的初診患者41 例(非糜爛型20 例，糜爛型21 例)，年齡18～65 歲，經臨床和病理確診為OLP(診斷參考[1])。根據病損基底部黏膜是否伴有糜爛分為非糜爛型和糜爛型。均無系統及免疫性疾病，不伴皮損，未經過任何治療。對照組15 例來自正頜外科手術的正常口腔黏膜。本研究經貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會審核批準，所有研究對象均知情同意。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人IL-17多抗、兔抗人FOXP3多抗(Proteintech, 美國)；鼠抗人TGF-β1單抗(eBioscience，美國)；DAB(北京中杉)；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit(TakaRa，日本)；熒光定量PCR儀(BIO-RAD CFX96，美國)；核酸蛋白分析儀(Gene Quant 100，美國)；YS100光學顯微鏡(Nikon，日本)；qPCR引物序列(上海生工)詳見表 1。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化 免疫組化超敏二步法檢測OLP病損組織切片中IL-17、FOXP3、TGF-β1的表達。檢測IL-17時采用微波抗原修復(0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液；中火8 min，斷火5 min，中火6 min)；檢測FOXP3和TGF-β1時用高溫高壓修復(0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液；3 min)。一抗濃度：IL-17多抗(1∶50)，FOXP3多抗(1∶50)，TGF-β1單抗(1∶500)。二抗用PV6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物。操作嚴格按試劑盒說明進行，以PBS代替一抗作為空白對照。

結果判讀:陽性染色表現為棕黃色顆粒。IL-17和TGF-β1染色后主要位于胞漿中，FOXP3主要位于胞核中。采用盲法在光學顯微鏡下隨機觀察每片5 個×400 倍視野(參照Fu等[7]的方法計算分析)。陽性細胞≤5%為0 分；6%～25%為1 分；26%～50%為2 分；51%～75%為3 分；>75%為4 分。細胞染色強度:不染色計0 分;淡黃色計1 分; 棕黃色計2 分; 棕褐色計3 分。采用兩計分方法之積進行結果判定，并計算陽性細胞數平均百分比。0～2 分為陰性(-)，3～5 分為弱陽性(+)，6～8 分為中度陽性(++)，9～12 分為強陽性(+++)。將+～+++都歸為陽性表達。

1.3.2 qPCR 取樣本組織約50 mg，Trizol法提取總RNA，并測定A260/A280值，估計RNA純度。取1 μg RNA逆轉錄為cDNA。按FastStart Essential DNA Green Master試劑盒說明書在冰上操作，配制10μl qPCR反應體系(表 2)。在熒光定量PCR儀中進行95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s完成后面的39 個循環。通過擴增曲線和溶解曲線分析排除非特異性擴增，每個樣本重復2 次，使用2-△Ct法進行相對定量分析。

表 2 熒光定量PCR反應體系

1.4 統計學分析

應用SPSS 19.0進行統計分析。非正態分布資料采用中位數(四分位間距)進行描述,2 組間均數比較采用秩和檢驗；計數資料采用卡方檢驗，相關分析采用Spearman相關性分析，P<0.05差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 OLP中IL-17、FOXP3和TGF-β1的表達

41 例OLP中有35 例(85.37%)見大量的IL-17陽性表達在固有層淋巴細胞中；少量IL-17散在分布于正常口腔黏膜的上皮及上皮下層浸潤的細胞，陽性表達率20.00%(3/15)。OLP中FOXP3陽性表達率為87.80%(36/41)，陽性細胞主要位于固有層淺層淋巴細胞中；正常黏膜組織中陽性率為13.33%(2/15)，散在分布于上皮及上皮下層浸潤的細胞。TGF-β1在OLP中呈強陽性表達，陽性率為82.93%(34/41)，主要分布于固有層淋巴細胞中；而在正常口腔黏膜陽性率為13.33%(2/15)，主要分布于基底層、棘層及顆粒層；經統計學分析，OLP病損中IL-17、FOXP3和TGF-β1的陽性表達率均顯著高于正常對照組(P<0.01)(圖 1，表 3)。

2.2 OLP病損組織中IL-17、RORc、FOXP3mRNA的表達

OLP病損中IL-17、RORc、FOXP3mRNA的相對表達量高于正常組，差異具有統計學意義(Z1=-2.44,Z2=-2.95,Z3=-2.41;P<0.05)；但OLP兩型間差異無統計學意義(P>0.05)(圖 2)。

圖 1 IL-17、FOXP3和TGF-β1在正常對照組及OLP固有層淋巴細胞的表達(×400)

表 3 IL-17、FOXP3和TGF-β1在OLP組織中的表達

圖 2 非糜爛型、糜爛型OLP病損組織和對照組中IL-17、RORc、FOXP3mRNA的表達

Spearman相關性分析顯示RORc與FOXP3mRNA的相對表達量呈正相關(r=0.69,P<0.05)。糜爛型OLP中RORc/FOXP3高于正常組(P<0.05)；但非糜爛型OLP與對照組相比差異無統計學意義(圖 2)。

3 討 論

OLP是一種較常見病因未明的口腔黏膜慢性炎性疾病。目前大部分的研究支持免疫因素在OLP病因及發病機制中的作用。研究表明不僅Th17細胞在OLP的發病起中到重要作用，而且Treg細胞也參與其中[3-6]。但是2 種細胞數量變化及它們與OLP臨床分型間的關系不盡相同。

Th17細胞以分泌高水平的IL-17為特征，具有強大的促炎作用并參與多種自身免疫性及炎性疾病的發生發展。本研究顯示OLP病損中IL-17的陽性表達率顯著高于對照組(P<0.01)，推測Th17細胞在OLP局部病損組織中發揮著促炎作用。目前，學者們認為OLP病損中Th17細胞及其相關因子如IL-17、IL-23、IL-22的表達均高于正常組[8-10]。有研究[4]指出CD4+IL-17+細胞數量在正常對照組、斑紋型與糜爛型OLP中有增高趨勢, 但無統計學差異。而Piccinni等[11]只在糜爛型OLP病損中發現Th17細胞及其相關因子的表達高于正常組，因此他們認為Th17細胞參與了糜爛型OLP的致病過程。鑒于以上不同觀點，本研究通過定量檢測Th17細胞的細胞因子IL-17及特征性轉錄因子RORc發現OLP中IL-17及RORcmRNA均高于對照組(P<0.05)，表明Th17細胞參與了OLP的局部病理反應。然而它們在OLP兩型中差異無統計學意義，推測Th17細胞分泌的促炎因子IL-17與疾病的嚴重程度無關。

與Th17細胞功能不同，Treg細胞在外周免疫耐受的維持中發揮核心作用[12]。它主要通過細胞依賴的抑制作用或者釋放細胞因子如IL-10、TGF-β等發揮抗炎作用。叉頭框轉錄因子3(FOXP3)被認為是Treg群體功能和發展中的一個關鍵調節因子。本研究免疫組化及qPCR結果均顯示，OLP病損中FOXP3表達增加(P<0.05)，提示Treg細胞參與了OLP的局部病理反應。本研究進一步檢測了Treg的細胞因子TGF-β1，發現它在OLP固有層中呈強陽性表達且高于對照組(P<0.05)。研究表明TGF-β1在下調T細胞介導的免疫反應和控制自身免疫中發揮著重要作用[13]。Sugerman等[14]發現OLP淋巴細胞中TGF-β1和TβR-Ⅰ表達幾乎缺失，提示TGF-β1/TβR-Ⅰ信號通路在OLP細胞免疫中存在障礙，推測OLP局部病損中由于TGF-β1受體途徑障礙導致Treg細胞增殖。

本研究OLP病損中RORc與FOXP3mRNA的相對表達量呈正相關，提示Th17細胞的改變可能協同Treg細胞參與了OLP的免疫調節過程。目前Th17/Treg平衡在OLP中的研究較少，為了探討其在OLP局部病損致病機制中的作用，本研究進一步分析了RORc/FOXP3的變化，發現糜爛型OLP高于對照組(P<0.05)，但非糜爛型OLP與正常組相比差異無統計學意義，推測Th17/Treg失衡可能參與了糜爛型OLP的致病過程，這與謝三祥等[5]結論一致。為探尋失衡原因，本研究中IL-17及RoRc在OLP中都升高，推測Th17細胞通過分泌IL-17發揮促炎作用。與謝三祥等[5]觀點不同，IL-17及RoRc的表達與OLP臨床分型無關，可能是不同研究組中研究對象本身免疫狀態差異造成的。此外，TGF-β1增高提示Treg抗炎作用可能由于TGF-β1受體途徑障礙導致Treg細胞的增殖。Th17與Treg細胞關系復雜，分化途徑相同，功能相反，還可相互轉化。對于OLP中Th17/Treg平衡的確切調控機制仍需進一步研究。

綜上，本研究表明Th17/Treg失衡可能參與了糜爛型OLP病損的形成。對Th17/Treg細胞平衡調控的深入研究,將可能為OLP患者的治療提供新的靶點。