Myosin 1H基因多態性與骨性下頜后縮的相關性研究

尹倩 王小琴

骨骼肌收縮依賴結構和功能完整的肌球蛋白重鏈異構體[5]。肌球蛋白重鏈(MHC)通過復雜組合形成的肌球蛋白，是肌原纖維粗絲的組成單位。肌球蛋白具有收縮調節功能,對骨骼肌纖維收縮起重要作用。研究顯示, 骨骼肌的可塑性與肌球蛋白重鏈異構體的種類、組成及相互轉化關系密切，免疫組化和基因研究發現僅咬肌纖維就表達了4種不同的肌球蛋白重鏈異構體[6]。對于I類肌球蛋白基因(MYO1H)，第30外顯子中單核苷酸多態性可導致野生型堿基G突變為A，從而使脯氨酸與原鏈中第1001位的亮氨酸發生置換。單核苷酸多態性是指DNA序列中由于單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態性。SNPs廣泛存在于基因組中，是一種穩定遺傳的早期病變，與疾病相關[7]。它是繼限制性片斷長度多態性、簡單重復序列之后的第3代分子遺傳標記。其中MYO1H的rs3825393多態位點被報道與南亞人群MR發生顯著相關[8]，由于東、南亞人群存在地域和種族差異,因此本實驗以國內山西太原地區人群為研究對象，對MYO1H rs3825393多態位點與該疾病的相互關系及影響進行探討。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

對照組：①Ⅰ類骨面型，磨牙中性關系；②頭顱側位片顱底角=127.3°±3.8°，下頜角=119.8°±5.6°、后前面高比=0.65±0.04、上下頜大小形態正常：∠SNA=78°～86°，∠SNB=76°～84°，∠ANB=2°～ 4°。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本收集和DNA提取 知情同意后，分別抽取空腹肘靜脈血液樣本3 ml，EDTA抗凝處理。使用DNA Blood Mini kit(OMEGA)試劑盒并根據使用說明提取兩組患者全基因組DNA，-4 ℃保存。

1.2.2 MYO1H rs3825393多態位點目的基因擴增應用Premier 5軟件設計引物，序列為F5’-GGCTTACTTCCCTCCCAGAG-3’，R5’-CTGTGGCAACAGCATTCTTC-3’(Invitrogen合成)。使用聚合酶鏈法擴增DNA樣本內目標序列，PCR反應體系：DNA模板50～100 ng，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μl(TransGen，中國)，上下游引物各1 μl(10 pmol/L)，無菌去離子水補足總體積至25 μl，混勻。PCR擴增條件：95 ℃ 預變性2 min，循環條件94 ℃ 1 min，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環。擴增產物經電泳分析證實PCR擴增成功。取PCR產物5 μl，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DI 2000 DNA marker為分子量標準品，電泳完畢后用凝膠成像分析系統照相并保存。

1.2.3 酶切和多態性檢測 取純化后的PCR產物10 μl加入總體積25 μl的酶切反應體系中，體系內還有：2U Sau96I內切酶(BioLabs，America), 2 μl酶切緩沖液，無菌去離子水補至25 μl，37 ℃水浴2 h。酶切片段在1.5%瓊脂糖凝膠上以120 V電壓電泳30 min，結束后于紫外燈下根據酶切圖譜判斷基因型。具體酶切位點為5’…GG(N) CC…3’和3’…CC(N) GG…5’。

1.3 統計學分析

分析2 組基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。基因型、等位基因分布及其與易感性的關系采用SPSS 21.0統計軟件包處理，采用χ2檢驗比較2 組在基因型和等位基因分布上是否存在統計學差異。

2 結 果

2.1 2 組患者基線資料及頭影測量值比較

病例組和對照組性別、年齡比較差異無顯著性(P>0. 05)(表 1)；SNB、ANB角在2 組間有顯著差異，其余測量值在2 組間均相似，證明所選MR患者及對照者符合診斷及納入標準，具有代表性(表 2)。

表 1 2 組患者基線資料

表 2 基因型間頭影測量值比較

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗

2 組MYO1H rs3825393位點基因型分布經 Pearsonχ2檢驗均符合 Hardy-Weinberg平衡，具有代表性(表 3)。

表 3 對照組與病例組遺傳平衡性檢測結果

2.3 目的基因擴增和酶切分析

目的基因擴增片段長度為302bp(圖 1)，Sau96I酶切后，野生GG型(76bp和226bp)者為2 條電泳帶；G→A突變后產生一個酶切位點，雜合突變AG型(76bp，226bp，302bp)者為3 條電泳帶；純合突變AA型(302bp)者只有1 條電泳帶(圖 1～2)。

圖 1 MYO1H基因rs3825393位點擴增電泳圖

圖 2 MYO1H基因rs3825393位點產物經限制性內切酶Sau96I酶切后的電泳圖

2.4 MYO1H rs3825393位點基因型及等位基因頻率比較

本實驗中GG型共35 例，其中對照組24 例，病例組11 例；AG型37 例：對照組13 例，病例組24 例；AA型8 例：對照組3 例，病例組5 例。3 種基因型在對照組中分布分別為60%、 33%、7%，在病例組中分別為27%、60%、13%，2 組間基因型分布差異有顯著性(表 4)。等位基因G、A在對照組中數量、占比分別為61(76.2%)、19(23.8%)，在病例組中數量、占比分別為46(57.5%)、34(42.5%)，分布在2 組間有顯著性差異(表 5)。

表 4 2 組患者MYO1H rs3825393位點基因型分布 (%)

Tab 4 The distribution of MYO1H rs3825393 target genotype in the 2 groups (%)

注： ①GG/AG/AA 2 組間基因型分布差異有顯著性

表 5 2 組患者MYO1H rs3825393位點等位基因分布(%)

注： ①G型和A型等位基因頻率2 組間差異有顯著性

2.5 多因素分析

采用Logistic回歸法分析年齡、性別及MYO1H多態性與MR易感性的關系，結果顯示整個回歸模型具有統計學意義，MR與基因型有相關性(P<0.05)；與年齡、性別無相關性(P>0.05)(表 6)。

表 6 多因素分析結果

注：χ2=10.373，P=0.035

3 討 論

MR是一類發育性疾病，病因包括環境、遺傳及二者相互作用。研究顯示環境因素對MR起一定作用：局部因素如不良習慣,替牙障礙，肌平衡失調等；全身疾病如佝僂病，炎癥如中耳炎等會影響髁突及下頜骨發育；下頜骨及髁突外傷也會造成下頜骨發育障礙。

Richards等[8]對MR患者和下頜正常者進行了MYO1H SNP分析，通過比較第30外顯子間的差異，發現rs3825393多態位點增加了MR的風險。

在本實驗凝膠電泳圖中，對照組中有3 例出現1 個條帶-302bp，代表基因型為AA純合子；有24 例出現2 個條帶-76bp，226bp，代表基因型為GG純合子；有13 例出現三個條帶-76bp，226bp，302bp，代表基因型為AG雜合子。同樣，病例組中有5 例電泳結果出現一個條帶，基因型為AA；11 例出現2 個條帶，基因型為GG；24 例出現3 個條帶，基因型為AG。而判斷等位基因時，將雜合子的一半認為是等位基因G，另一半認為是等位基因A。經χ檢驗，2 組間等位基因和基因型分布差異均有顯著性。病例組中AG基因型數量明顯高于其他兩型，A等位基因的攜帶頻率明顯高于對照組，說明國內漢族骨性MR人群在MYO1H rs3825393多態位點處由G突變為A占很高的比例，攜帶AG、AA基因型的人群增加了MR的發病風險。

本研究首次報道國內漢族人群MYO1H rs3825393多態位點與MR的相關性，但目前MR的致病機制尚處于初步探索階段，不可否認遺傳因素在其發病中占重要地位，MYO1H 也與下頜骨發育關系密切。本實驗只對該基因的一個SNP位點進行了探究，并未探討該基因啟動子、內含子及編碼區的其余多態位點，因此不能排除其他突變與MR存在作用的可能性。本研究在樣本量及地域方面存在一定局限性， 下一步擬采用基因測序方法對酶切結果進行驗證。同時該疾病也與環境因素有關，擬后期行多因素分析。

(收稿： 2017-12-14

修回： 2018-02-03)