消退素D1對牙周炎大鼠齦溝液中炎癥因子影響的研究

馬飛 唐彩金 方梅飛 陳怡

消退素(Resolvin)是由ω-3 多不飽和脂肪酸衍生的新的一種內源性促炎癥消退介質，具有抑制白細胞浸潤，下調促炎介質等生物學效應[1]。人工合成消退素可能具有促進牙周炎炎癥消退，從而達到治療牙周炎的目的[2]。本實驗研究消退素D1(Resolvin D1，RvD1)對牙周炎大鼠牙周狀況及齦溝液炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IL-6等)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

RvD1(Sigma公司,美國)；濾紙條、4#縫線(博士德公司)；蠟塊(博仁生物)；切片機(Leica公司，德國)；牙周探針(豪孚迪器材公司)；ELISA試劑盒(武漢華美)。

1.2 實驗動物模型建立

清潔級SD雄性大鼠30 只，4 周齡，體質量100～150 g(廣西醫科大學動物實驗中心提供)。大鼠牙周炎模型的建立：30 只大鼠用10%水合氯醛全麻后，使用牙科探針對大鼠右上頜第二磨牙牙齦進行分離，分離牙齦后使用縫線4#(直徑0.040 mm)放入齦溝內并結扎固定，在結扎固定過程中縫線盡量放入大鼠的齦溝內，將結扎端轉至頰側作為口腔微生物的滯留裝置誘導牙周炎的產生，術后按牙周炎食譜喂養2 周[3-4]。

1.3 分組與檢測

建模成功后將30 只清潔級SD大鼠隨機分為5 組(n=6)。A組為牙周炎對照組，B、C、D、E組為治療組。檢測各組大鼠牙周探診深度(PD)、松動度，并收集和檢測各組大鼠齦溝液中IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達情況。然后通過尾靜脈注射一次性給藥的方法對B、C、D、E組分別給予1、10、50、100 ng/ml不同濃度的RvD1進行干預。用藥后7 d再次檢測各組相應指標。

齦溝液收集和檢測方法如下：將烘烤干燥的濾紙條置于大鼠第二磨牙腭側近遠中采集齦溝液，每牙8 根，每根15 s，置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA方法檢測齦溝液IL-1β、TNF-α、IL-6 濃度。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 牙周狀況變化

建模第2周，大鼠第二磨牙有牙周袋形成，均有Ⅰ～Ⅲ度松動。B、C、D、E組經不同濃度的消退素治療7 d后，牙齦紅腫明顯好轉，松動度減輕，牙周探診深度變淺，差異具有統計學意義(P<0.001)(圖 1)。

圖 1 各組大鼠PD值

2.2 大鼠齦溝液中IL-1β、TNF-α、IL-6水平變化

ELISA結果顯示，治療前各組間比較IL-1β、TNF-α、IL-6差別無統計學意義；治療前后比較，IL-1β在各組中(包括對照組)表達差別均有統計學差異(P<0.05)，但對照組水平最高，E組(100 ng/ml組)最低，各治療組間比較差別無統計學意義(圖 2)；TNF-α的表達，對照組前后差別無統計學意義，各治療組前后比較差異均有統計學意義(P<0.05)，其中D組(50 ng/ml)、E組(100 ng/ml)差別具有顯著性(P<0.001)，各治療組間比較差別無統計學意義(圖 3)；IL-6的表達，對照組前后差別無統計學意義，各治療組前后差別也均具有統計學差異(P<0.05)，各治療組間比較差別無統計學意義， IL-6的表達隨著RvD1濃度的升高而降低，具有一定的RvD1濃度依賴性(圖 4)。

圖 2 治療前后各組大鼠齦溝液中IL-1β水平

圖 3 各組大鼠齦溝液中TNF-α水平

圖 4 各組大鼠齦溝液中IL-6水平

3 討 論

RvD1是一種新型內源性抗炎促消退介質，通過阻礙白細胞浸潤、下調炎癥介質、促進凋亡的中性粒細胞及細胞碎片的吞噬攝取等方式，在炎癥早期發揮促進炎癥消退的作用[2]。有研究報道，消退素對于炎性疾病如：牙周病、哮喘、膿毒癥及視網膜病變等，顯示出了良好的抗炎促消退作用[5]。Garcia等[6]發現RvD1不僅能顯著降低關節炎模型大鼠的痛覺過敏，同時還檢測到炎癥因子TNF-α和 IL-1β的釋放減少了。一項關于慢性胰腺炎所致痛覺過敏的研究中，RvD1不僅降低了炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6的釋放，而且發揮了顯著的抑制痛覺過敏的效應[7]。

消退素的功能主要是抑制白細胞浸潤可降低中性粒細胞表面CD18分子的表達、抑制白細胞在血管壁的滾動、減少白細胞向炎癥部位滲出和聚集[8-9]。D類消退素可在在盲腸結扎穿孔誘導的小鼠膿毒癥中顯著降低TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-23、IL-17等促炎細胞因子的水平[10]。本研究成功建立了大鼠牙周炎模型，經過給大鼠牙齒綁線的方法，并按照牙周炎食譜喂食，2 周后即可形成牙周炎。在建模兩周內，大鼠活動輕度減少，出現少食、掉毛、體重減輕等癥狀。2周后發現綁線的牙齒的牙齦紅腫明顯，線周圍有較多食物殘渣滯留，探診極易出血，有深牙周袋形成，牙齒松動明顯。本實驗經取患牙齦溝液行ELISA檢測發現大鼠經注射消退素后發現，大鼠牙周炎癥狀明顯改善，PD明顯減少，松動度也恢復正常。齦溝液內的TNF-α、IL-1β、IL-6明顯低于用藥前(對照組)，這提示RvD1是通過抑制炎癥因子的釋放從而減輕大鼠牙周炎的癥狀。實驗中對照組TNF-α、IL-1β、IL-6水平也均出現不同程度降低，而且IL-1β前后差異也有統計學意義，但均值均高于治療組，可能因為本研究牙周炎模型為人為創傷輔助食物喂養引起，各炎癥因子在炎癥早期水平較高，轉為慢性后逐漸降低，呈現由啟動到消退的高度有序化過程，在炎癥消退階段，炎癥的終止受到機體內源性促炎癥消退介質(pro-resolving mediator)的調控[11]。本實驗提示輔以人工合成消退素，可能促進炎癥的消退。

有研究提示，RvD1可能是通過抑制了嗜中性粒細胞招募炎性因子的再聚集，以及激活吞噬細胞清除病原體的作用[12]。另外，RvD1可抑制多形核中性白細胞的浸潤，從而促進牙周組織的再生，保護牙槽骨的破壞，促進組織愈合以及重建破壞的牙槽骨[13]。

本研究還發現，較小濃度的RvD1即可抑制IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放。在1 ng/ml的RvD1作用下，IL-1β、TNF-α、IL-6與對照組比較，均有明顯的抑制作用，且IL-6具有RvD1的濃度梯度依賴性，隨著RvD1濃度的升高而升高。近期有研究發現，RvD1能有效減輕關節炎大鼠機械痛敏，并減少炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放，可能是通過對p-ERK通路的抑制來發揮作用的，且NF-κB/p65也被顯著激活，這提示RvD1下調炎癥因子的表達，與這2 個通路相關且相互作用，發揮強有力的促炎消退的作用[14-15]。綜上所述，RvD1可有效地減輕牙周炎的癥狀，促進牙周組織的愈合，促進骨組織的重建和牙周組織的再生，這可能與RvD1下調炎癥因子，激活吞噬細胞或抑制中性粒細胞對炎癥因子的募集作用有關，但其中確切的機制作用需更多的實驗加以驗證。