大果山楂酵素發酵過程中組分及抗氧化性研究

張巧，陳春喜，陳振林，周錦菊，段振華，*

（1.賀州學院食品與生物工程學院，廣西賀州542899；2.賀州學院食品科學與工程技術研究院，廣西賀州542899；3.廣西果蔬保鮮和深加工研究人才小高地，廣西賀州542899）

大果山楂是一種藥食兼用的水果，在廣西很多地區均有種植。與普通山楂相比，大果山楂果粒大，易加工與儲藏，鮮食味道好且營養豐富，其品質在全國目前已知的山楂品種中也名列前茅[1-2]。因為大果山楂口感酸甜又有理氣健脾、消食導滯的功能，市場上出現不少以大果山楂為原料的產品，大多是經初步加工的產品，如山楂餅、山楂糕、山楂飲料等。但目前市場及學術研究中，山楂發酵制品僅限于酒和醋，對于山楂酵素這種重要的生物發酵制品，鮮有報道。酵素是由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多種微生物復合發酵水果、蔬菜而成的，具有較高的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及超氧化物歧化酶活性的一類生物發酵制品，因此酵素也稱為酶[3]。酵素在多種微生物的作用下，不僅保存了果蔬原有的營養成分，還能形成一些新的活性成分，增強其營養和保健價值[4]。這些豐富的營養物質使得酵素具有消炎抑菌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、保護肝臟等功效[5-8]。林琳等以人參，靈芝等滋補品開發的天然酵素，已被證實具有抗腫瘤和調節免疫力的作用[9]。

酵素在我國的研究起步較晚，天然酵素的開發和利用目前還位于初步水平，而且功能成分含量并不高，往往無法達到媒體宣傳的作用。近年來我國學者開始重視酵素食品的研究，并已取得一些進展。但與先進國家還存在不少差異，日美等國對酵素食品的研究和開發十分重視，市面上酵素產品已經商業化，利用酵素產品來加工生產酵素食品也已經市場化，但我國還未實現酵素食品商業化，因此需要加快對酵素產品的研究。本研究對大果山楂酵素發酵過程中的某些組分及抗氧化活性的變化規律進行探究，為大果山楂酵素產品的生產和開發提供一定的技術支撐和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果山楂，賀州水果建材市場購買；福林酚試劑（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；2，2-聯苯基-1-苦基肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；碳酸鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸鈉、重絡酸鉀等（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

722N可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；高速冷凍離心機：Eppendorf公司；恒溫水浴鍋：上海宜昌儀器紗篩廠；電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 大果山楂酵素的制備工藝

大果山楂→洗凈→瀝干→切塊→熱燙→消毒→加糖→自然發酵→滅菌→酵素

操作要點：將新鮮的大果山楂洗凈后瀝干，切成4塊，去核去梗，沸水中加熱2 min后立即置于冷水冷卻至常溫。山楂塊與紅糖經紫外處理45 min進行消毒，發酵罐經高壓殺菌（121℃，15 min）使其無菌。將消毒后的山楂裝入發酵罐，在其上中層分別加入山楂果肉25%（質量分數）的紅糖，密封。發酵罐置于暗處，室溫（25±1）℃進行自然發酵，發酵期間定期放氣。在發酵第 5、10、15、20、25、30、40、55 天分別取得酵素樣液，離心（10 000 r/min，10 min），上清待測。

1.4 pH值的測定

取不同發酵天數的酵素樣品上清液5 mL于試管中，采用pH計測定其pH值。

1.5 總糖的測定

采用3，5-二硝基水楊酸法測定總糖的含量并稍作修改[10]，具體操作為：取1 mL稀釋樣液，加入4 mL 6 mol/L的HCl，沸水加熱15 min，冷卻后用6 mol/L氫氧化鈉溶液中和，蒸餾水定容至100 mL。取水解后的樣液，加入DNS試劑，沸水浴反應后測定其540 nm處的吸光值。采用0～1 mg/mL的葡萄糖溶液制備標準曲線，得線性回歸方程為：y=0.817x-0.012，R2=0.996。根據回歸方程和樣液的吸光值，測定樣液中總糖（以葡萄糖計）的含量。

1.6 酒精度的測定

采用比色法測定樣液中的酒精度并稍作修改[11]。具體操作為：取5 mL的稀釋樣液至試管中，加入1 mL 2%重絡酸鉀溶液，5mL濃硫酸，搖勻，沸水加熱10min，冷卻后測定600 nm下的吸光值。采用0%～0.2%（體積分數）的乙醇溶液制備標準曲線，得線性回歸方程為：y=2.588x-0.006，R2=0.998。根據回歸方程和樣液的吸光值，計算各個樣液的酒精度。

1.7 總酚的測定

總酚含量的測定參照徐輝艷的福林-酚法并稍作修改[12]。采用0～0.02 mg/mL的沒食子酸溶液制備總酚的標準曲線，得線性回歸方程為：y=1.622x-0.009，R2=0.999。根據沒食子酸的線性回歸方程和樣液的吸光值，測定各個樣液的總酚含量。

1.8 還原力的測定

還原力的測定參照Yildirim等的方法并稍作修改[13]。以蒸餾水調零，測定各個樣品在700 nm處的吸光值，還原力與吸光值大小成正比。

1.9 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除率的測定參照Blois等的方法[14]。具體操作為：將一定量的稀釋樣液與2×10-4mol/L的DPPH溶液（80%乙醇配制）等體積混合，室溫條件下靜置30 min，以蒸餾水調零，測定各個樣品在517 nm時的吸光值。DPPH自由基清除率由公式（1）計算而得。

式中：A1為DPPH溶液與樣品稀釋液的吸光值；A2為樣品稀釋液和80%乙醇的吸光值；A0為DPPH溶液和蒸餾水的吸光值。

1.10 羥基自由基清除能力的測定

羥基自由基清除率的測定參照Liu等[15]的方法。具體操作為：在一定量的待測樣液中，依次加入雙氧水、水楊酸鈉和硫酸亞鐵，混勻，37℃恒溫水浴1 h，以蒸餾水調零，測定562 nm處的吸光值。羥基自由基清除率由公式（2）計算而得。

式中：a1為不加樣品的吸光值；a2為加樣品的吸光值。

2 結果與分析

2.1 大果山楂酵素發酵過程中pH值的變化

大果山楂酵素發酵過程中pH值的變化能反應產酸情況以及發酵是否正常。pH值隨發酵時間的變化情況見圖1所示。

圖1 大果山楂酵素發酵過程中pH值的變化Fig.1 Changes in pH during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

由圖1可知，發酵前30天，大果山楂酵素液的pH值在 3.14～3.37 范圍內變化，發酵 5 d～10 d 下降，10 d～20 d上升，20 d～30 d再下降，30天后pH值趨于穩定。在發酵5 d～10 d，發酵瓶內產生大量氣泡，這是微生物的生長和代謝產生了大量的二氧化碳。由于二氧化碳氣泡在發酵瓶內不穩定，使得酵素液的pH值上下浮動。30 d后進入慢速發酵階段，pH值趨于穩定。

2.2 大果山楂酵素發酵過程中總糖含量的變化

紅糖是大果山楂酵素的主要原料之一，作為酵素液中微生物的重要碳源，總糖含量的變化是反應酵素液中微生物活動情況的指標之一[16]。大果山楂酵素發酵過程中總糖含量的變化情況見圖2所示。

圖2 大果山楂酵素發酵過程中總糖含量的變化Fig.2 Changes in tatal sugar content during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

由圖2可知，隨著發酵時間的延長，大果山楂酵素的總糖含量在發酵剛開始的前15天有明顯的上升，達到1.0 g/mL以上，這是由于酵素制備時紅糖采用分層添加的方式，發酵初期，上層的紅糖還未完全滲入溶液中，隨發酵時間增加，酵素液的總糖含量會有所提高。發酵25天后，由于微生物的消耗利用，糖含量迅速下降。發酵40天后的總糖含量緩慢減少，這是由于微生物活動降低，糖消耗量減少。發酵55 d時的總糖含量低于0.06 g/mL。

2.3 大果山楂發酵過程中酒精度的變化

大果山楂果肉及紅糖只經過了紫外消毒，而沒有進行滅菌，因此山楂果肉及紅糖中仍存留某些微生物，如酵母菌、醋酸菌等。酵母菌在發酵過程中會利用糖生成乙醇，而醋酸菌能利用乙醇產生醋酸，且乙醇含量影響發酵飲料的口感，因此發酵過程中乙醇的變化是一個重要的指標之一。大果山楂酵素發酵過程中酒精度的變化情況見圖3所示。

由圖3可知，在發酵前20天內，酵母菌生長代謝較快，產生大量的乙醇，酵素的酒精度含量在這段時間范圍內持續增加，在20 d達到最高18.21%vol，之后開始不斷下降。

2.4 大果山楂酵素發酵過程中總酚含量的變化

酚類物質是大果山楂的主要活性成分，大果山楂酵素發酵過程中總酚含量的變化情況見圖4所示。

圖3 大果山楂酵素發酵過程中酒精度的變化Fig.3 Changes in alcohol content during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

圖4 大果山楂酵素發酵過程中總酚含量的變化Fig.4 Changes in tatal phenols during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

由圖4可以看出，大果山楂酵素總酚含量隨著發酵時間的增加呈現出先上升后下降的。發酵20 d內，酵素的總酚含量迅速增加，從1.72 mg/mL上升至最大值7.61 mg/mL；20 d～40 d大果山楂酵素中總酚含量開始持續下降；40 d后，總酚含量無明顯變化，穩定在2 mg/mL左右。發酵過程中總酚含量的增加與多因素有關，可能原因是發酵過程中部分酚類物質的持續溶出，也可能是一些大分子酚類物質被微生物利用生成小分子酚類物質，使總酚含量增加[17-18]。然而，發酵20d后，較多的酚類物質被不斷氧化和降解，造成其含量的下降。

2.5 大果山楂酵素發酵過程中還原力的變化

大果山楂中的多酚、黃酮類物質使其具有較強的抗氧化活性[19]，大果山楂酵素發酵過程中還原力的變化情況見圖5所示。

由圖5可知，還原力隨著發酵時間的增加呈現出先上升后下降的變化趨勢，發酵到25 d時的還原力吸光值最高5.082（即還原力最強），25 d后開始下降。還原力的變化趨勢與多酚含量具有一定的相關性[20]。

2.6 大果山楂酵素發酵過程中DPPH自由基清除率的變化

DPPH自由基常用于評價物質的抗氧化活性，大果山楂酵素發酵過程中的DPPH自由基清除率的變化情況見圖6所示。

圖5 大果山楂酵素發酵過程中還原力的變化Fig.5 Changes in reducing capacity during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

圖6 大果山楂酵素發酵過程中DPPH自由基清除率的變化Fig.6 Changes in DPPH radical scavenging ability during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

DPPH自由基清除能力被廣泛地應用在評價短時間內的抗氧化活性[21]。由圖6可知，大果山楂酵素的DPPH自由基清除率隨著發酵時間的增加呈現出先上升后下降的變化趨勢；前20天內持續上升直至最高84.11%，20 d之后一直下降，發酵55 d時，DPPH清除率比發酵5 d提高了19.16%。蔣增良研究的葡萄酵素在天然發酵過程中的DPPH自由基清除率增加了12.5%[22]。酚類物質的增加很有可能是DPPH自由基清除能力提高的重要原因。

2.7 大果山楂酵素發酵過程中羥基自由基清除率的變化

大果山楂酵素發酵過程中的羥基自由基清除率的變化情況見圖7所示。

由圖7可知，大果山楂酵素的羥基自由基清除率也隨著發酵時間的增加呈先上升后下降的變化趨勢，在前15天內一直上升，且在第15 d至最大值59.57%，之后開始緩慢下降至51.66%左右穩定，發酵第55天，羥基自由基清除率提高了13.36%。

圖7 大果山楂酵素發酵過程中羥基自由基清除率的變化Fig.7 Changes in hydroxyl radical scavenging ability during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

3 結論

研究發現，大果山楂酵素發酵過程中，發酵30 d內的pH值在3.14～3.37范圍內變化，30 d后pH值穩定在3.15。總糖含量、酒精度、總酚含量、還原力、DPPH和羥基自由基清除率均呈先升高后降低的趨勢。總糖含量在發酵20 d達到最大值1.05 g/mL，55 d后的總糖低于0.06 g/mL；發酵20 d時的酒精度達到最高18.21%vol，總酚含量最大值7.61 mg/mL；發酵25 d時還原力最高；此外，發酵55 d時的DPPH、羥基自由基清除率分別提高了19.16%、13.36%，大果山楂酵素自然發酵至15d～25 d時，其抗氧化能力最強。對大果山楂酵素發酵制備過程中的主要組分及抗氧化活性變化規律進行探究，有利于確定合適的發酵周期，為大果山楂酵素產品的生產和開發提供一定的理論依據和技術指導。