響應面法優(yōu)化超聲波微波協(xié)同提取樹莓多酚工藝研究

（河南科技學院新科學院，河南新鄉(xiāng)453003）

河南省是樹莓（Raspberry）的天然有機場，非常適合樹莓的生長，目前在河南延津建有千畝樹莓基地，是中原地區(qū)特色農(nóng)產(chǎn)品[1]。樹莓是膳食多酚的豐富來源，研究表明日常食用樹莓可以改善血脂異常，抗菌消炎，減少人體和動物慢性疾病的氧化應激反應[2-6]。樹莓多酚中的花青素在濃度為50 μg/mL能夠抑制脂質(zhì)氧化，抑制率超過50%，在濃度為100 μg/mL時對環(huán)氧化酶的抑制率為27.5%～33.1%[7]，樹莓花青素還具有抑制細胞毒素形成和體外抗氧化能力，抑制動脈硬化，抑制癌細胞增殖的能力等功能[8]。Tulio等[9]的研究證明樹莓多酚具有較強的抗菌消炎能力，并對抗癌活性進行了驗證。通過成熟樹莓多酚和其中各單體酚抗氧化能力測定發(fā)現(xiàn)，鞣花酸在樹莓多酚的抗氧化能力中占主要地位，對DPPH·和·OH都有較好的清除作用，清除率分別達到57.82%和74.8%[10-11]。另有學者研究證明樹莓多酚中的鞣花酸通過抑制癌細胞增殖和誘導癌細胞凋亡途徑治療人體宮頸癌，并取得了顯著的療效[12-13]。

在提取多酚的工藝過程中，超聲波輔助提取、微波輔助提取已經(jīng)有了廣泛的應用[14-18]，這兩種方法比直接溶劑萃取的效率有了很大的提升，但是這兩種方法提取溫度高、提取時間長會導致多酚在提取過程中發(fā)生降解。而超聲波-微波協(xié)同提取新技術合理利用超聲波的空化效應和微波高能釋放的熱效應，集超聲波微波兩者優(yōu)勢于一體，克服了單獨使用超聲波或微波提取的缺陷，解決了在低溫常壓環(huán)境下，對植物中活性成分的快速、高效提取，且大大降低了目標成分被破壞的風險[19-22]，目前超聲波微波協(xié)同提取法在樹莓多酚提取方面的研究較少。為了最大化的提取樹莓多酚，在超聲波微波協(xié)同提取時要考慮提取時間，提取溫度，乙醇體積分數(shù)，超聲波微波功率等單因素對試驗結果的影響，并進行條件優(yōu)化，一般來說，優(yōu)化提取工藝可以通過驗證或者統(tǒng)計學的方法，相比較來說，統(tǒng)計學方法可以減少試驗次數(shù)并驗證各因素間交互作用，響應面法就是一種具有代表性的統(tǒng)計學方法，已經(jīng)被廣泛在農(nóng)業(yè)和工程方向用于改進、提高和優(yōu)化工藝[23]，但是在超聲波微波協(xié)同提取樹莓多酚方面還沒有應用。

本研究以樹莓為原料，利用超聲波微波協(xié)同技術提取樹莓多酚，采用響應面法優(yōu)化樹莓多酚的提取工藝，提高樹莓多酚的提取率，為紅樹莓多酚的進一步研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樹莓：2017年5年采于河南延津樹莓基地，成熟期采摘，采摘后立即儲存在液氮中，后在-80℃冰箱中速凍，冷凍干燥稱粉末，置于-20℃冰箱中保存，使用前解凍。

沒食子酸：Sigma公司；福林酚試劑：北京索萊寶公司；抗壞血酸、檸檬酸、乙醇：國藥集團化學試劑有限公司，試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

CW-2000型超聲波-微波協(xié)同萃取儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；UV7500型紫外可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；KQ-100E型超聲波清洗器：上海精密儀器有限公司；DHG-9620A型恒溫干燥箱：上海和呈儀器制造有限公司；SW22型恒溫水浴鍋：德國JULABO公司；JA2003型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多酚標準曲線的建立

采用優(yōu)化的福林酚法測定樹莓多酚含量，以沒食子酸為標品，分別配成不同濃度加入福林酚試劑，避光條件下，室溫反應2 h，在765 nm條件下測定吸光值，以吸光度值為縱坐標，沒食子酸濃度為橫坐標建立標準曲線。建立的標準曲線回歸方程為：y=0.231 1x+0.003 2，R2=0.998 3，y 為 OD765，x 為沒食子酸質(zhì)量濃度。樹莓多酚提取液稀釋至合適濃度，加入福林酚試劑反應，通過標準曲線得出多酚含量。

1.3.2 樹莓多酚提取工藝

在250 mL錐形瓶中加入一定體積分數(shù)的乙醇100 mL、5 g樹莓凍干粉和1%的抗壞血酸攪拌均勻，置于超聲波微波協(xié)同萃取儀中，在一定功率、溫度和時間條件下萃取，然后將萃取液進行抽濾棄去濾渣，上清液旋轉蒸發(fā)濃縮至10 mL，通過標準曲線計算出多酚含量。總酚含量單位用mg等量沒食子酸/g干重表示。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 提取時間對樹莓多酚含量的影響

稱取5份5g樹莓凍干粉，在乙醇體積分數(shù)為60%，提取溫度為30℃，超聲波微波功率300 W條件下，分別提取 10、15、20、25、30min，考察不同提取時間對樹莓多酚含量的影響。

1.3.3.2 提取溫度對樹莓多酚含量的影響

稱取5份5g樹莓凍干粉，在乙醇體積分數(shù)為60%，提取時間為20 min，超聲波微波功率300 W條件下，分別改變提取溫度 20、25、30、35、40 ℃，考察不同提取溫度對樹莓多酚含量的影響。

1.3.3.3 乙醇體積分數(shù)對樹莓多酚含量的影響

稱取5份5 g樹莓凍干粉，在提取時間為20 min，提取溫度為30℃，超聲波微波功率300 W條件下，分別添加體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，考察不同體積分數(shù)乙醇對樹莓多酚含量的影響。

1.3.3.4 超聲波微波功率對樹莓多酚含量的影響

稱取5份5g樹莓凍干粉，在乙醇體積分數(shù)為60%，提取溫度為30℃，提取時間為20 min，分別設定超聲波微波功率 200、250、300、350、400 W，考察不同超聲波微波功率對樹莓多酚含量的影響。

1.3.4 響應面設計

選取提取時間、提取溫度、乙醇體積、超聲波微波功率4個單因素進行試驗，在此基礎上選擇提取時間、提取溫度和乙醇體積3個對樹莓多酚含量影響顯著的因素，采用Design-Expert8.0建立三因素三水平的Box-Behnken模型，試驗設計因素編碼水平如表1所示。

表1 響應面設計因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗測定3次，試驗結果采用平均值±標準差表示，用Design-Expert8.0進行響應面設計和方差分析。

2 結果與分析

2.1 微波超聲波協(xié)同提取樹莓多酚單因素試驗

2.1.1 提取時間對樹莓多酚含量的影響

提取時間對樹莓多酚含量的影響結果如圖1所示。

圖1 提取時間對樹莓多酚含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on raspberry polyphenols

當提取時間在10 min～20 min時，樹莓多酚的含量隨著提取時間的延長而提高，當提取時間超過20 min，樹莓多酚的含量有所下降，這是因為隨著時間的延長，提取出的樹莓多酚部分氧化降低了提取液中樹莓多酚的含量。在提取時間20 min時多酚含量達到最大值75.87 mg/g，因此選擇提取時間為20 min。

2.1.2 提取溫度對樹莓多酚含量的影響

提取溫度對樹莓多酚含量的影響結果如圖2所示。

當提取溫度在20℃～30℃時，樹莓多酚的含量隨著提取溫度的升高而提高，當提取溫度超過30℃，樹莓多酚的含量呈現(xiàn)下降趨勢，這是因為隨著溫度的升高，樹莓多酚部分氧化降低了提取液中樹莓多酚的含量。在提取溫度30℃時多酚含量達到最大值75.04 mg/g，因此選擇提取溫度為30℃。

圖2 提取溫度對樹莓多酚含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on raspberry polyphenols

2.1.3 乙醇體積對樹莓多酚含量的影響

乙醇體積對樹莓多酚含量的影響結果如圖3所示。

圖3 乙醇體積分數(shù)對樹莓多酚含量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on raspberry polyphenols

當乙醇體積低于60%時，樹莓多酚的含量隨著乙醇體積的增加而提高，當乙醇體積超過60%，樹莓多酚的含量呈下降趨勢，這是因為在乙醇體積分數(shù)較低時，乙醇可以破壞細胞壁進入細胞內(nèi)部將酚類物質(zhì)溶出，當乙醇體積分數(shù)較高時，乙醇引起蛋白質(zhì)變性在細胞壁形成致密結構阻礙酚類物質(zhì)的溶出。在乙醇體積60%時多酚含量達到75.32 mg/g，選擇乙醇體積為60%。

2.1.4 超聲波微波功率對樹莓多酚含量的影響

超聲波微波功率對樹莓多酚含量的影響結果如圖4所示。

圖4 超聲波微波功率對樹莓多酚含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic microwave power on raspberry polyphenols

樹莓多酚的含量隨著超聲波微波功率的提高而緩慢提高，但是經(jīng)過方差分析發(fā)現(xiàn)不同超聲波微波功率條件下的多酚含量沒有顯著性差異（p＜0.05）。考慮到經(jīng)濟成本選擇超聲波微波功率為300 W，此因素不作為響應面試驗的因素。

2.2 模型和方差分析

根據(jù)單因素試驗設計了因素水平表（表1）進行響應面試驗，將每組試驗結果填入表2，用Design-experts軟件進行方差分析（表3）。

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface experiment results

表3 模型方差分析表Table 3 ANOVA of model

通過二次多項回歸分析得到如下回歸方程：

其中Y是響應值（樹莓多酚含量），A、B、C分別代表單因素提取時間，提取溫度和乙醇體積3個自變量。

由方差分析表可知模型的F=14.84，p=0.000 9＜0.01，說明總模型極顯著，失擬項F=2.23，p=0.227 3＞0.05，說明失擬項相對于純誤差來說是不顯著的，而模型決定系數(shù)R2=0.950 2表明該模型擬合程度良好，綜合以上結果表明這個模型方程適合任意變量組合下的多酚預測。提取時間一次項和二次項、提取溫度二次項極顯著，提取溫度和乙醇體積分數(shù)交互項、乙醇體積分數(shù)二次項顯著。根據(jù)各因素F值可知各因素對樹莓多酚提取影響力的關系為提取時間＞乙醇體積分數(shù)＞提取溫度。

2.3 響應面分析

圖5 提取時間和提取溫度對樹莓總多酚影響的響應面圖Fig.5 Effect of extraction time and temperature on total polyphenols from raspberry

響應面試驗的自變量交互作用通過三維圖和等高線圖來表示（如圖5～圖7），等高線呈橢圓狀越明顯說明交互作用越顯著，對樹莓多酚含量的影響越顯著，由等高線圖可以看出任意兩因素交互作用的顯著程度，提取溫度和乙醇體積分數(shù)的交互作用顯著。通過軟件Design-Expert優(yōu)化出的工藝條件是：提取時間21.85 min，提取溫度30.07℃，乙醇體積分數(shù)57.78%，樹莓多酚的含量預測值為76.77 mg/g。

圖6 提取時間和乙醇體積分數(shù)對樹莓總多酚影響的響應面圖Fig.6 Effects of extraction time and ethanol volume on total polyphenols from raspberry

2.4 驗證試驗

由于工藝參數(shù)有小數(shù)出現(xiàn)，在實際操作中無法控制，所以將優(yōu)化的工藝條件再次優(yōu)化，提取時間22 min，提取溫度30℃，乙醇體積分數(shù)60%，在此工藝條件下重復提取樹莓多酚5次，獲得的樹莓多酚含量（76.85±0.084）mg/g與預測值非常接近，兩者沒有顯著性差異（p＜0.05），進一步驗證了優(yōu)化的工藝條件的穩(wěn)定性。

3 結論

通過單因素試驗和響應面試驗，優(yōu)化出超聲波微波協(xié)同提取樹莓多酚的工藝條件為：提取時間22 min，提取溫度30℃，乙醇體積分數(shù)60%，在此工藝條件下樹莓多酚含量為（76.85±0.084）mg/g，三因素對響應值的主次順序為：提取時間＞乙醇體積分數(shù)＞提取溫度，其中提取時間對樹莓多酚含量影響極為顯著。本研究建立的提取工藝提高了樹莓多酚的提取效果，試驗在較低溫度下進行減少了樹莓多酚氧化，極大程度保留樹莓多酚的活性，是一種可廣泛應用的樹莓多酚的提取方法，可為樹莓多酚的工業(yè)化生產(chǎn)提供研究基礎。