不同采收期烏天麻中多糖的提取及含量測定

馬風偉，李瑩，潘成，曹森，張光文，王瑞，楊興成，鄧青芳

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽550005；2.貴州烏蒙騰菌業有限公司，貴州畢節551601；3.貴州師范大學貴州省山地環境信息系統與生態環境保護重點實驗室，貴州貴陽550001）

天麻（Rhizoma Gastrodiae）為蘭科植物天麻（Gastrodia elata Bl.，G.elata）的干燥塊莖。具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡的功效，臨床多用于治療小兒驚風、癲癇抽搐、破傷風、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木、風濕痹痛等癥[1-3]。多糖是由醛糖或酮糖通過糖苷鍵聚合連接組成的生物大分子化合物。其功能除具有骨架結構（如纖維素、殼聚糖）和儲存養分（如淀粉、糖原）外，有些多糖還具有特殊的生物活性[4-9]。天麻多糖是天麻的活性成分之一，不僅含量高，且具有增強免疫力、改善記憶、清除自由基、抗病毒、抗血壓等藥理作用[10-14]。隨著衛生部將天麻列為藥食兩用品種，天麻保健功能方面的開發利用前景廣闊，因此加速天麻多糖的開發尤為重要[15-16]。

本試驗采用單因素試驗研究提取時間、提取溫度、液固比對多糖得率的影響，并結合響應面法優化提取工藝參數。最后應用優化的提取方案對不同采收期的貴州大方烏天麻中的多糖進行提取并進行含量測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-無水葡萄糖對照品：中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201707；氯仿、濃硫酸、丙酮、無水乙醇、正丁醇、苯酚均為國產分析純：天津市科密歐化學試劑有限公司。

天麻藥材：購自貴州烏蒙騰菌業有限公司，并經貴州師范大學陳華國教授鑒定為蘭科植物天麻的塊莖，樣本保存在貴陽學院食品與制藥工程學院，貯存編號分別為：20180010、20180011、20180012。

1.2 儀器與設備

UV-2700紫外-可見分光光度計：日本島津制作所；FA1004電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；HH-8數顯恒溫循環水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；FD-1C-80真空冷凍干燥機：北京博醫康試驗儀器有限公司；GZX-9146MBE電熱鼓風干燥箱：上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；SK7200H高頻臺式超聲波清洗器：上海科導超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 天麻粗多糖的制備

稱取干燥至恒重的天麻粉末（過60目篩）10.0 g，依次經石油醚、無水乙醇50 mL回流脫脂、脫色素處理2次，每次60 min，藥渣揮干至無醇味，加水300 mL在80℃下提取2小時后過濾，濾液減壓濃縮至20 mL，加入Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1，體積比）10 mL以除去游離蛋白質，重復7次，濾液加入無水乙醇使乙醇濃度達80%，靜置過夜，離心（3 000 r/min）過濾，濾渣用少量無水乙醇、丙酮洗滌，然后加蒸餾水溶解，冷凍干燥，即得天麻粗多糖。

1.3.2 天麻粗多糖中糖含量的測定

改良的硫酸-苯酚法[17-18]進行測定。

1.3.2.1 標準曲線的建立

取干燥至恒重（105℃，6 h）的D-無水葡萄糖標準品10 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。分別精密吸取 200、300、400、500、600、700 μL標準品溶液置于具塞試管中，分別加入蒸餾水使體積為1.0 mL，然后加入5%的苯酚溶液1.0 mL并迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后在室溫放置5 min后置沸水中加熱10 min，取出后流水冷卻至室溫；另取蒸餾水1.0 mL加入苯酚和硫酸，同上操作為空白對照。于490 nm波長下測定吸光度。以葡萄糖濃度c為橫坐標（X），吸光度值A為縱坐標（Y）繪制標準曲線。

1.3.2.2 樣品中多糖含量的測定

稱取天麻粗多糖10 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加水稀釋定容。吸取天麻粗多糖溶液1.0mL，然后按標準曲線制備項下方法操作，測定吸光度，用回歸方程計算天麻粗多糖中的糖濃度，并計算多糖含量。

1.3.3 天麻多糖得率的計算

天麻多糖得率的計算公式如下：

式中：W為天麻多糖得率，%；C為從回歸曲線中計算得出的糖濃度，mg/mL；V 為定容體積，mL；M1為天麻粗多糖質量，mg；M2為天麻原料質量，mg；M3為配制天麻粗多糖溶液時稱取的質量，mg。

1.4 天麻多糖提取的單因素考察

1.4.1 液固比對天麻多糖得率的影響

稱取干燥的天麻粉末10.0 g，經脫脂、脫色素處理后，按照液固比分別為 10∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50∶1（mL/g）加水提取，提取溫度為80℃，提取時間75 min，然后按照1.3.1試驗方法處理，并用硫酸-苯酚法測定糖含量，計算多糖得率。

1.4.2 提取溫度對天麻多糖得率的影響

稱取干燥的天麻粉末10.0 g，經脫脂、脫色素處理后，液固比 30 ∶1（mL/g），提取溫度分別為 50、60、70、80、90℃，提取時間75 min，然后按照1.3.1操作，計算多糖得率。

1.4.3 提取時間對天麻多糖得率的影響

稱取干燥的天麻粉末10.0 g，經脫脂、脫色素處理后，液固比 30∶1（mL/g），提取溫度 80℃，提取時間分別為 30、45、60、75、90 min，然后按照 1.3.1 操作，計算多糖得率。

1.5 響應面法優化試驗

根據響應面Box-Behnken的設計原理，稱取干燥的天麻粉末10.0 g，在單因素考察的基礎上，以液固比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）為自變量，以天麻多糖得率為響應值，進行響應面法優化試驗，其因素與水平見表1。

表1 響應面法試驗的因素及水平Table 1 Factors and levels of the independent variables for response surface methodology

1.6 不同采收期烏天麻中多糖含量的測定

取不同采收期（立冬、冬至、立春）的大方烏天麻，干燥后粉碎過篩，然后按照1.5優化的提取工藝參數制備天麻粗多糖，然后稱取天麻粗多糖粉末，按照1.3.2方法測定多糖含量，計算多糖得率。

1.7 統計分析

采用SPAW 18.0對數據進行統計分析，結果以平均值±標準差表示。其中P＜0.05為統計性顯著差異，P＜0.01為統計性差異極為顯著。

2 結果與分析

2.1 標準曲線與線性范圍

以葡萄糖濃度c為橫坐標（X），吸光度A為縱坐標（Y），繪制標準曲線，如圖1所示，回歸方程為：Y=10.838X-0.006 2，R2=0.998 5，說明葡萄糖標準品溶液在濃度為0.020 6 mg/mL～0.072 1 mg/mL的范圍內線性關系良好。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Calibration curve obtained by glucose

2.2 單因素考察結果

2.2.1 液固比對天麻多糖得率的影響

在提取溫度為80℃，提取時間為75 min的條件下，不同液固比對天麻多糖得率的影響如圖2所示。

圖2 液固比對天麻多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on polysaccharide extraction rate

由圖 2 可知，液固比在 10 ∶1（mL/g）～30 ∶1（mL/g）范圍內，天麻多糖得率從17.46%快速增加到28.44%，而液固比在 30 ∶1（mL/g）～40 ∶1（mL/g）范圍內時，多糖得率增加趨勢明顯放緩，這可能是隨著液固比的增加，天麻組織中的多糖被浸提完全，而在液固比為50 ∶1（mL/g），多糖得率為 28.23%，呈現下降趨勢，可能是液固比的增加，導致提取溶劑的體積增加，同時無水乙醇用量增加，在水提醇沉及純化過程中出現多糖損失增加，導致天麻多糖的得率出現下降。因此選擇液固比選為 30 ∶1（mL/g）。

2.2.2 提取溫度對天麻多糖得率的影響

在液固比為 30∶1（mL/g），提取時間為 75 min的條件下，不同提取溫度對天麻多糖得率的影響如圖3所示。

圖3 提取溫度對天麻多糖得率的影響Fig.3 Effect of temperature on polysaccharide extraction rate

由圖3可知，在溫度50℃～70℃范圍內，隨著溫度的升高，多糖得率增加顯著，當溫度為80℃時，天麻多糖得率達到最大值，繼續升高溫度，多糖得率開始下降，這可能是因為適當的溫度增加有助于多糖分子的熱力學運動，促進其溶出，但過高的溫度會引起多糖分析的聚合或降解，使其溶解度改變。因此提取溫度選為80℃。

2.2.3 提取時間對天麻多糖得率的影響

在液固比為 30∶1（mL/g），提取溫度為 80 ℃時，研究不同提取時間對天麻多糖得率的影響，結果如圖4所示。

圖4 提取時間對天麻多糖得率的影響Fig.4 Effect of time on polysaccharide extraction rate

由圖4可知，在30 min～60 min范圍內，隨著提取時間的延長，多糖得率不斷增加；當提取時間在75 min時，多糖得率趨于穩定，達到28.57%，繼續延長提取時間，多糖得率基本穩定，這可能是在75 min后，提取液與天麻細胞內的多糖濃度達到平衡。因此提取時間選為75 min。

2.3 響應面法優化試驗結果

2.3.1 響應面法試驗設計

在單因素考察結果的基礎上，采用Design-Expert 8.06軟件對試驗數據進行多元回歸擬合，響應面法試驗設計見表2，通過響應面法擬合得到天麻多糖得率的二次多元回歸方程：Y=30.20+3.15×A-2.54×B-0.21×C+1.40×AB+3.55×AC-0.18×BC-4.41×A2-3.79×B2-3.19×C2，R2=0.975 0。

表2 響應面法試驗設計與結果Table 2 Experimental design and the results for response surface methodology

續表2 響應面法試驗設計與結果Continue table 2 Experimental design and the results for response surface methodology

方差分析結果如表3所示。

表3 方差分析Table 3 Data of variance analysis

由表3可知，失擬項不顯著，表明所得方程的模擬成功，試驗值與預測值有很好的擬合度，可以采用該模擬方程對天麻多糖得率的提取工藝進行預測和優化分析。液固比（A）和提取溫度（B）對天麻多糖得率的影響極為顯著（P＜0.01），二次項對多糖得率都呈現極顯著影響；液固比（A）與提取時間（C）對多糖得率具有極顯著影響。

2.3.2 響應面結果分析

液固比、提取溫度和提取時間3個因素的兩兩交互作用對天麻多糖得率影響的響應面圖如圖5所示。

圖5 響應面圖Fig.5 The response surface map

響應面圖可以顯示各試驗因素的不同水平之間與響應值的函數關系，同時可以較直觀的獲取試驗設計中的最優工藝參數。由圖5可以看出，液固比的坡面比提取時間要陡峭（圖5b），說明液固比對天麻多糖得率影響較大；提取溫度的坡面比提取時間要陡（圖5c），說明提取溫度對天麻多糖得率影響較大。通過對響應面圖的陡峭程度分析，發現液固比與提取溫度對天麻多糖得率的影響最大，而提取時間對其影響較小，這與前述方差分析結果一致。由響應面得出最佳提取工藝為：液固比 34∶1（mL/g）、提取溫度 77℃、提取時間78 min，在此提取條件下，天麻多糖的預測得率為31.14%。

2.3.3 驗證試驗

在響應面法優化的最佳工藝條件下，進行3次驗證試驗，為使現實中更加便捷地進行試驗，將提取溫度設定為75℃，提取時間設定為80 min，結果顯示，天麻多糖得率為：30.88%，相對標準偏差為0.67%，實際值和預測值相差僅為0.26%，說明響應面法優化的提取工藝參數準確可行。

2.4 不同采收期貴州大方烏天麻中多糖含量的測定

采用優化的最佳提取工藝條件，對不同采收期貴州大方烏天麻中的多糖進行提取，并進行含量測定，計算多糖得率，結果見表4。

表4 不同采收期烏天麻中的多糖得率（n=3）Table 4 Results of polysaccharides content determination of G.elata samples obtained from different harvest periods（n=3）

由表4可知，不同采收期烏天麻中多糖的得率差異顯著，其中冬至采收的烏天麻中多糖得率最高，最高達到32.2%，其次為立冬采收，而立春采收的烏天麻中多糖得率最低，最低為20.6%。同時發現，不同采收期烏天麻中的多糖得率均大于20%，表明在這一段時間內采收均能保證天麻多糖的含量。

3 結論

本文采用響應面法對天麻多糖的提取工藝進行優化，確定最佳提取工藝為：液固比34∶1（mL/g）、提取溫度77°C、提取時間78 min，在此提取條件下，天麻多糖的預測得率為31.14%。通過驗證試驗發現天麻多糖得率為：30.88%，相對標準偏差為0.67%，實際值和預測值相差僅為0.26%，說明響應面法優化的提取工藝參數準確可行。最后采用優化的多糖提取工藝對不同采收期的貴州大方烏天麻中的多糖進行提取及含量測定，發現不同采收期烏天麻中的多糖得率差異顯著，其中冬至采收的烏天麻中多糖得率最高，最高可達32.2%。本研究對天麻多糖的工業化提取及深度開發利用具有一定的參考價值。