王敏,田珍燕,王蔚新
(黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,大別山特色資源開(kāi)發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北省經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北黃州 438000)
板栗屬殼斗科栗屬堅(jiān)果類植物,為落葉喬木。板栗果肉的開(kāi)發(fā)利用一直受到廣泛關(guān)注,作為加工廢棄物——板栗殼,還沒(méi)有得到有效地開(kāi)發(fā)和利用。從板栗殼中提取出來(lái)的色素,是一種水溶性好、著色力強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定的天然棕色素[1]。其主要活性成分為多酚類化合物,有一定的抗氧化和抑菌等作用,廣泛用于食品、日用化學(xué)用品和藥品等產(chǎn)品的生產(chǎn)。
植物多酚類化合物的傳統(tǒng)提取溶劑多為乙醇、酸、堿等,但這些溶劑成本高、污染性強(qiáng),且有殘留風(fēng)險(xiǎn)。采用水作為提取溶劑,具有廉價(jià)、環(huán)保、更適合工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。超聲波能促進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)的可溶性物質(zhì)快速溶解到溶劑中,可用于各種植物活性成分的輔助提取,具有耗時(shí)短、得率高、消耗溶劑少等特點(diǎn)。蔣孟君等[2]采用超聲波輔助提取可食用玫瑰花多酚,總多酚含量達(dá)到93.81 mg/g,效果顯著。植物多酚抗腫瘤、抗衰老等生理活性與其具有的清除自由基和抗氧化能力密切相關(guān)[3]。馬承慧等[4]究了松針多酚對(duì)DPPH·和·OH兩種自由基的清除效果,結(jié)果表明其具有較好的抗氧化能力。目前板栗總苞、種皮中含有的多酚物質(zhì)已有一定研究,如石恩慧等[5]研究了板栗總苞多酚的抗氧化性,匙丹丹[6]研究了板栗種皮提取、純化和相關(guān)性質(zhì)。但板栗殼(中果皮)中多酚相關(guān)研究相對(duì)較少,不足以為板栗殼的相關(guān)研究提供更加完整的理論依據(jù)。本研究采用超聲波輔助水提法提取板栗殼多酚物質(zhì),并通過(guò)測(cè)定板栗殼多酚提取液總抗氧化能力及其對(duì)5種不同抗氧化體系的清除效果,研究其抗氧化活性,旨在為板栗殼多酚的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)實(shí)現(xiàn)變廢為寶,進(jìn)一步促進(jìn)板栗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
板栗:黃岡市黃商集團(tuán)購(gòu)物中心。
福林酚試劑(生化試劑):合肥博美生物;沒(méi)食子酸(分析純):天津市大茂化學(xué)試劑廠;大孔樹(shù)脂(AB-8型):陜西樂(lè)博生化科技有限公司;無(wú)水乙醇(分析純):天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司;無(wú)水碳酸鈉(分析純):天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;鹽酸(分析純):中平能化集團(tuán)開(kāi)封東大化工有限公司;鐵氰化鉀(分析純):CANSPEC CHINA;維生素C(分析純):天津市天力化學(xué)試劑有限公司等。
UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海菁華科技儀器有限公司;SB25-12DTDN型超聲波清洗機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司;普通玻璃層析柱(2.0 cm×45 cm):陜西樂(lè)博生化科技有限公司等。
1.3.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
稱取0.250 g沒(méi)食子酸,用水溶解定容至50 mL,分別取母液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL于50 mL容量瓶中稀釋成不同濃度梯度的備用液。分別從上述備用液中取0.2 mL置于10 mL容量瓶中,再分別加入0.5 mL福林酚混勻,30 s之后加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液,混勻、定容、暗處放置2 h后760 nm處測(cè)吸光度。
1.3.2 總多酚的測(cè)定及提取率計(jì)算
取10 g板栗殼粉按料液比1∶30(g/mL)添加甲醇于500 mL圓底燒瓶中,70℃水浴回流1 h。過(guò)濾取濾液同上利用福林酚試劑法測(cè)吸光度(以沒(méi)食子酸計(jì))。根據(jù)回歸方程計(jì)算提取率:
多酚提取率(按沒(méi)食子酸計(jì))(mg/g)=([C×V/M)/1 000]×100%
式中:C為多酚質(zhì)量濃度,μg/mL;V為多酚提取液總體積,mL;M為板栗殼粉質(zhì)量,g。
1.3.3 板栗殼多酚粗提液的制備工藝流程
板栗殼→去雜、清洗、烘干→粉碎→加水超聲波提取→過(guò)濾取濾液→測(cè)吸光度→計(jì)算提取率(以沒(méi)食子酸計(jì))
1.3.4 多酚提取工藝優(yōu)化
分別研究料液比、超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度這4個(gè)因素對(duì)板栗殼多酚提取率的影響。料液比取1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g/mL);超聲時(shí)間取 0.5、1.0、1.5、2.0 h;超聲功率取 200、300、400、500 W;超聲溫度取 35、50、65、80 ℃。
新樹(shù)脂先用95%乙醇浸泡24 h至充分溶脹后,裝柱,用去離子水洗至無(wú)醇味殘留[7]。將100 mL板栗殼多酚粗提液以2 BV/h過(guò)柱,以10 mL每管收集,以去離子水作為參比液,依次在380 nm條件下測(cè)定吸光度,達(dá)到泄漏點(diǎn)(多酚濃度為初始的1/10)時(shí)停止加樣,水洗未吸附殘液至流出液為無(wú)色,用紫環(huán)反應(yīng)檢測(cè)洗脫終點(diǎn),最后用100 mL 50%乙醇溶液以2 BV/h過(guò)柱洗脫至無(wú)色。
1.5.1 總抗氧化能力的測(cè)定
分別取 1.00 mL 不同質(zhì)量濃度(30、60、90、120、150 μg/mL)的樣品溶液與系列同等質(zhì)量濃度的VC溶液置于試管中,再加入0.2 mol/L、pH值=6.6磷酸鈉緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL,在50℃水浴中放置20min后,加入2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸,取混合液5mL并加入4 mL去離子水和1.0 mL、0.1%氯化鐵溶液,混合均勻,在700 nm下測(cè)定其吸光度A(以VC作為對(duì)照品)。吸光度越高,則總抗氧化能力越強(qiáng)[8]。
1.5.2 DPPH·清除率測(cè)定
參考朱潔等[10]的方法,并作適當(dāng)修改。分別取2.0 mL 不同質(zhì)量濃度(5、10、15、20、25、30、60、90、120、150 μg/mL)的樣品溶液與系列同等質(zhì)量濃度的VC溶液,再分別加入等量0.057 mg/mL用無(wú)水乙醇配制的DPPH溶液,搖勻反應(yīng)30 min,在517 nm下測(cè)定吸光度為A1。用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液代替樣品液測(cè)定吸光度A0,用無(wú)水乙醇代替DPPH溶液測(cè)定吸光度A2。DPPH·清除率的計(jì)算見(jiàn)公式:

1.5.3 O2-·清除率測(cè)定
參考李霄等[9]的方法,并作適當(dāng)修改。各個(gè)試管分別吸取50 mmol/L、pH=8.2的Tris-HCI緩沖液4.5 mL,在25℃水浴中放置20 min后,再分別加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度(10、20、30、60、90、120、150 μg/mL)的樣品溶液與系列同等質(zhì)量濃度的VC溶液,然后加入0.4 mL、25.0 mmol/L的鄰苯三酚溶液,混勻后在25℃水浴中放置5 min,最后加入終止反應(yīng)液1.0 mL、8.0 mol/L的HCl溶液,在波長(zhǎng)為325 nm處測(cè)定吸光度A1。用雙蒸水代替樣品液測(cè)定吸光度A0。按下式計(jì)算清除率:

1.5.4 ABTS+·清除率測(cè)定
參考范金波等[11]的方法,并作適當(dāng)修改。取適量體積7 mmol/L的ABTS溶液和等體積2.4 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液,混合均勻后室溫避光放置12 h~16 h,形成ABTS+·母液備用。然后在734 nm波長(zhǎng)處,將ABTS+·母液用10 mm/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至吸光度為0.70±0.002,記作A0。分別取60 μL不同質(zhì)量濃度(30、60、90、120、150 μg/mL)的樣品溶液與系列同等質(zhì)量濃度的VC溶液,再分別加入6.0 mL ABTS+·母液,搖勻后室溫避光放置10 min,在波長(zhǎng)為734 nm處測(cè)定吸光度為A1。用蒸餾水代替ABTS+·母液測(cè)定吸光度為A2。 ABTS+·清除率的計(jì)算同公式(1)。
1.5.5 NaNO2清除率測(cè)定
參考朱潔等[10]的方法,并作適當(dāng)修改。分別取2.0mL不同質(zhì)量濃度(30、60、90、120、150 μg/mL)的樣品溶液與系列同等質(zhì)量濃度的VC溶液,再分別加入1.0 mL、5 μg/mL亞硝酸鈉溶液,搖勻后于37℃水浴30 min,取出立即加入1.0 mL、0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液,充分混勻后室溫放置15 min,再依次加入500 μL、0.2%鹽酸萘乙二胺溶液,混合均勻后靜置顯色15 min,在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1。用50%乙醇代替樣品測(cè)定吸光度為A0,用蒸餾水代替鹽酸萘乙二胺溶液測(cè)定吸光度A2。亞硝酸基清除率的計(jì)算同公式(1)。
1.5.6·OH清除率測(cè)定
參考馬承慧等[4]的方法,并作適當(dāng)修改。分別取1.0 mL 不同質(zhì)量濃度(30、60、90、120、150 μg/mL)的樣品溶液與同等質(zhì)量濃度的VC溶液,再分別加入1 mL、1 mmol/L硫酸亞鐵溶液和等體積1 mmol/L的過(guò)氧化氫溶液,以及2 mL、3 mmol/L鄰羥基苯甲酸溶液,搖勻后于37℃水浴30 min,在510 nm處測(cè)定吸光度A1。用蒸餾水代替鄰羥基苯甲酸測(cè)定吸光度A2,用蒸餾水代替樣品溶液測(cè)定吸光度A0。羥自由基清除率的計(jì)算同公式(1)。
以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),以760 nm波長(zhǎng)處的吸光度A為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid
回歸方程為:y=0.002 2x+0.022 5,R2=0.996 7。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到?jīng)]食子酸在質(zhì)量濃度為50 μg/mL~500 μg/mL區(qū)間內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
由吸光度的平均值計(jì)算可知:板栗殼粉總多酚含量為16.6 mg/g板栗殼粉,用于計(jì)算板栗殼多酚的提取率。
2.3.1 料液比對(duì)多酚提取率的影響
以料液比為橫坐標(biāo),以板栗殼多酚提取率為縱坐標(biāo),考察料液比對(duì)多酚提取率的影響,如圖2。
由圖2可知,隨著料液比的增大,板栗殼多酚提取率逐漸增大,但從1∶40(g/mL)處增長(zhǎng)開(kāi)始變緩慢,由此設(shè)定1∶40(g/mL)為較優(yōu)料液比。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)板栗殼的量一定時(shí),增加水的量可以降低板栗殼多酚濃度,從而更有利于多酚的溶出[12]。因此,在實(shí)際生產(chǎn)中可以采用適當(dāng)加大料液比的方法來(lái)獲得最大的提取率,但過(guò)大的料液比會(huì)增加水的用量,多酚含量幾乎不變,同時(shí)在工業(yè)上出現(xiàn)用水量大、經(jīng)濟(jì)支出高、不易濃縮的問(wèn)題。
2.3.2 超聲波時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響
以超聲時(shí)間為橫坐標(biāo),以板栗殼多酚提取率為縱坐標(biāo),考察超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響,如圖3。

圖2 料液比對(duì)多酚提取率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of polyphenols

圖3 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasound time on the extraction rate of polyphenols
由圖3可知,隨著超聲時(shí)間的增加,板栗殼多酚的提取率逐漸增大,從1.5 h處增長(zhǎng)開(kāi)始變緩慢。原因可能是過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間會(huì)導(dǎo)致部分板栗殼多酚發(fā)生氧化,因損耗而影響提取率。由此設(shè)定1.5 h為較優(yōu)超聲時(shí)間。
2.3.3 超聲波功率對(duì)多酚提取率的影響
以超聲功率為橫坐標(biāo),以板栗殼多酚提取率為縱坐標(biāo),考察超聲功率對(duì)多酚提取率的影響,如圖4。
由圖4可知,隨著超聲功率的增大,板栗殼多酚提取率先增大后減小,在功率400 W處出現(xiàn)峰值,說(shuō)明較優(yōu)的超聲功率為400 W。
2.3.4 超聲波溫度對(duì)多酚提取率的影響
以超聲溫度為橫坐標(biāo),以板栗殼多酚提取率為縱坐標(biāo),考察超聲溫度對(duì)多酚提取率的影響,如圖5。

圖4 超聲功率對(duì)多酚提取率的影響Fig.4 Effects of ultrasound power on the extraction rate of polyphenols

圖5 超聲溫度對(duì)多酚提取率的影響Fig.5 Effects of ultrasound temperature on the extraction rate of polyphenols
由圖5可知,板栗殼多酚提取率整體隨著超聲溫度升高而增大,提取率先逐漸增大,但在65℃處開(kāi)始呈現(xiàn)減小趨勢(shì)。原因可能是隨著溫度的升高,部分板栗殼多酚氧化損耗。因溫度65℃處出現(xiàn)峰值,故設(shè)定65℃為較優(yōu)的超聲溫度。
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)定正交因素水平表1,按照L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)見(jiàn)表2。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels of this experiment
由正交試驗(yàn)表得出最優(yōu)提取工藝條件為A3B1C1D2,即液料比 1 ∶45(g/mL)、超聲時(shí)間 1 h、超聲功率350 W、超聲溫度65℃。經(jīng)驗(yàn)證,在最優(yōu)提取工藝條件下板栗殼多酚的提取率達(dá)到96.9%,該結(jié)果比正交表中試驗(yàn)號(hào)8的提取率略低,原因可能是各單因素之間存在交互作用。但試驗(yàn)號(hào)8耗時(shí)更長(zhǎng)、超聲溫度更高,從生產(chǎn)成本方面考慮不具優(yōu)勢(shì)。
按照1.5.1試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn),以板栗殼多酚濃度為橫坐標(biāo),以吸光度A為縱坐標(biāo),板栗殼多酚的總抗氧化能力如圖6。

圖6 板栗殼多酚的總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of polyphenols from Chestnut Shell
由圖6可知,在一定濃度范圍內(nèi),板栗殼多酚提取液的總抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng),且板栗殼多酚的總抗氧化能力整體優(yōu)于VC。本試驗(yàn)結(jié)果與其買古麗·阿沙木等[8]研究的野薔薇多酚總抗氧化實(shí)驗(yàn)趨勢(shì)基本相同,區(qū)別在于野薔薇多酚的總抗氧化能力弱于VC。
按照1.5.2試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn),以板栗殼多酚濃度為橫坐標(biāo),以DPPH·的清除率為縱坐標(biāo),板栗殼多酚清除DPPH·的效果如圖7。

圖7 板栗殼多酚清除DPPH·的效果Fig.7 Effects of scavenging DPPH·on polyphenols from Chestnut Shell
植物多酚可與DPPH·中的單電子配對(duì),從而發(fā)生氧化使紫色醇溶液出現(xiàn)褪色現(xiàn)象。由圖7可看出,板栗殼多酚和VC都具有清除DPPH·的能力。當(dāng)板栗殼多酚濃度低于25 μg/mL時(shí),其清除DPPH·能力優(yōu)于VC;當(dāng)板栗殼多酚濃度高于25 μg/mL時(shí),其清除能力弱于VC,且其清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而減弱,究其原因,相關(guān)文獻(xiàn)并未給出解釋,具體原因還有待進(jìn)一步探究。從李霄等[9]研究馬鈴薯皮多酚清除DPPH·試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果,即低濃度馬鈴薯皮多酚清除DPPH·能力優(yōu)于VC,高濃度馬鈴薯皮多酚清除DPPH·能力弱于VC。由此可說(shuō)明,在低濃度條件下板栗殼多酚清除DPPH·的能力比VC強(qiáng)。
按照1.5.3試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn),以板栗殼多酚濃度為橫坐標(biāo),以O(shè)2-·的清除率為縱坐標(biāo),板栗殼多酚清除O2-·的效果如圖 8。

圖8 板栗殼多酚清除O2-·的效果Fig.8 Effects of scavenging O2-·on polyphenols from Chestnut Shell
由圖8可看出,板栗殼多酚清除O2-·能力整體弱于VC。隨著質(zhì)量濃度的增加,VC的清除能力逐漸增大,而板栗殼多酚在質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)出現(xiàn)清除率峰值。當(dāng)濃度高于20 μg/mL時(shí),板栗殼多酚的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸減弱,且在120 μg/mL時(shí)趨于平緩。從李霄等[9]及劉寧等[13]研究試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,但均未給出合理解釋,出現(xiàn)該現(xiàn)象的具體原因還有待進(jìn)一步探究。因此,在低濃度條件下板栗殼多酚具有清除O2-·的能力。
按照1.5.4試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn),以板栗殼多酚濃度為橫坐標(biāo),以ABTS+·的清除率為縱坐標(biāo),板栗殼多酚清除ABTS+·的效果如圖9。

圖9 板栗殼多酚清除ABTS+·的效果Fig.9 Effects of scavenging ABTS+·on polyphenols from Chestnut Shell
ABTS經(jīng)氧化后會(huì)生成藍(lán)綠色ABTS+·,植物多酚可清除ABTS+·,從而使ABTS+·母液在一定程度褪色。由圖9可看出,板栗殼多酚和VC都有清除ABTS+·的能力,且它們的清除能力都隨著質(zhì)量濃度的增加而增大。謝惠等[14]研究發(fā)現(xiàn)紅棗多酚對(duì)ABTS+·有一定的清除能力,在一定范圍內(nèi)其清除能力隨著紅棗多酚濃度增加而增大,但其清除率明顯低于VC。而本試驗(yàn)板栗殼多酚清除ABTS+·的能力優(yōu)于VC,說(shuō)明板栗殼多酚具有較好的清除ABTS+·的能力。
按照1.5.5試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn),以板栗殼多酚濃度為橫坐標(biāo),以亞硝酸鹽的清除率為縱坐標(biāo),板栗殼多酚清除亞硝酸鹽的效果如圖10。
亞硝酸鈉在弱酸性的條件下,與對(duì)氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺反應(yīng)后會(huì)生成紅色絡(luò)合物,該紅色絡(luò)合物溶液在536 nm處有強(qiáng)吸收[15]。當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí),紅色絡(luò)合物溶液會(huì)在一定程度褪色。由圖10可看出,板栗殼多酚和VC都有一定的清除亞硝酸基的能力,它們的清除能力都隨著質(zhì)量濃度的增加而增大,且整體上板栗殼多酚的清除能力比VC更強(qiáng)。亞硝酸鹽為強(qiáng)氧化劑,主要在腌肉、泡菜中出現(xiàn),食用后經(jīng)體內(nèi)胃酸作用轉(zhuǎn)化成亞硝胺,亞硝胺為強(qiáng)致癌物。因此,板栗殼多酚在該領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用潛力。

圖10 板栗殼多酚清除亞硝酸鹽的效果Fig.10 Effects of scavenging nitrite on polyphenols from Chestnut Shell
按照1.5.6試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn),以板栗殼多酚濃度為橫坐標(biāo),以·OH的清除率為縱坐標(biāo),板栗殼多酚清除·OH的效果如圖11。

圖11 板栗殼多酚清除·OH的效果Fig.11 Effects of scavenging·OH on polyphenols from Chestnut Shell
羥自由基能誘導(dǎo)DNA鏈斷裂和堿基改性從而引發(fā)腫瘤等疾病。植物多酚可通過(guò)清除羥自由基來(lái)減少羥自由基的產(chǎn)生,此時(shí)在510 nm下吸光度會(huì)降低。由圖11可看出,板栗殼多酚對(duì)羥自由基的清除作用隨著多酚濃度的增加逐漸降低,出現(xiàn)該現(xiàn)象的具體原因有待進(jìn)一步探究,而VC對(duì)羥自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng)。當(dāng)板栗殼多酚濃度低于55 μg/mL時(shí),其清除羥自由基的能力優(yōu)于VC;當(dāng)板栗殼多酚濃度高于55 μg/mL時(shí),其清除羥自由基的能力弱于VC。
1)利用超聲波水提法從板栗殼中提取多酚化合物,通過(guò)正交試驗(yàn)得到影響板栗殼多酚提取因素的主次順序?yàn)椋篊(超聲板栗殼功率)>B(超聲時(shí)間)>A(料液比)>D(超聲溫度);并得到最優(yōu)提取工藝條件:A3B1C1D2,即液料比 1 ∶45(g/mL)、超聲時(shí)間 1 h、超聲功率350 W、超聲溫度65℃,在該提取工藝條件下板栗殼多酚的提取率達(dá)到96.9%。
2)板栗殼多酚總抗氧化能力優(yōu)于VC,對(duì)5種抗氧化體系均有一定的清除能力,且在一定質(zhì)量濃度下其對(duì) DPPH·、ABTS+·、NaNO2和·OH 的清除效果優(yōu)于VC。因此,板栗殼多酚是一種良好的天然抗氧化劑,在食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。