響應面法優化酵子生產工藝研究

孫祥祥，劉長虹，*，張萌，王遠輝，張煌

（1.河南工業大學，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，河南鄭州450001；2.河南牧業經濟學院食品與生物工程學院，河南鄭州450044）

酵子作為傳統的面食發酵劑，在中國傳統的主食饅頭制作過程中起到不可或缺的作用[1]。由于酵子是一種多菌種面食發酵劑，并含有大量酵母中不具有的產脂霉菌、產香霉菌和多種細菌等可增加饅頭風味的菌種，使得蒸制的饅頭風味獨特，香甜可口[2-3]，得到老百姓的喜歡。雖然酵子出現很早，但是發展比較緩慢，制作工藝粗放，發酵條件不穩定，生產效率低，酵子品質不穩定，制約了酵子工業化生產[4-5]。如果采用工業化技術生產傳統口味饅頭，既可以大大提高面粉的附加值，也可產生可觀的經濟效益[6]。

響應面法能同時對多因子水平及其交互作用進行評價和預測，并能快速有效地確定多因子系統的最優條件[7]。本文以成酵子饅頭比容、硬度及感官品質為指標，在單因素試驗的基礎上，進行Box-Behnken試驗設計，對酵子制作所需的米酒、小曲、大曲添加量3個因素進行響應面優化試驗分析，旨在為酵子制作或批量生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

特一粉：鄭州金苑面業有限公司；高活性干酵母（低糖）：安琪酵母股份有限公司；蒸餾水：由蒸餾水儀器制得的Ⅲ級水；早秈稻米：安徽合肥；大曲：市售；小曲：蘇州糧油食品有限公司；糯米：湖北龍賽湖糧油食品有限公司；米酒：小麥與玉米深加工國家工程實驗室自制。

1.2 儀器與設備

SZH-20雙速雙動和面機：廣州旭眾食品機械有限公司；BS600L電子天平：上海友聲衡器廠；101A-3型電熱鼓風干燥箱：上海市實驗儀器總廠；DZF型真空干燥箱：北京市永光明醫療儀器有限公司；WFX-12-15-24-0豪華型霧化面食發酵箱：中山市豐盛電器廠；DS-671電子秤：上海寺崗電子有限公司；JBDZ-20白度儀：上海嘉定糧油儀器有限公司；硬度儀：小麥與玉米深加工國家工程實驗室自制。

1.3 試驗方法

1.3.1 米酒制作

糯米/水1∶1（g/mL）→浸泡（12 h）→過濾→蒸制（45 min）→冷卻（30℃）→1.6%小曲碾磨后溶解在蒸餾水中，與蒸熟糯米攪拌均勻，密封→恒溫（26℃）發酵48 h→米酒

（各配料比例均以第一次添加糯米總質量為基準）

1.3.2 酵子制作

米酒、大曲、米粉、小曲、375%溫水（30℃）混合均勻→發酵3 h→補加米粉200%，攪拌均勻成稠糊，發酵12 h→補加625%米粉、125%溫水，揉成面團，發酵3 h，成泡沫狀→補加83%米粉，攪拌均勻，發酵2 h→拍餅，25℃鼓風干燥48 h

（各配料比例均以第一次添加米粉總質量為基準）

1.3.3 饅頭制作

饅頭的制作工藝流程如下：面粉、酵子、酵母、水→和面→壓面→成型→醒發→蒸制→成品

將面粉、酵子3%、酵母0.2%、水45%加入和面機，先低速攪拌2 min，再高速攪拌10 min；自動壓面20次；手工成型；在溫度為35℃、相對濕度為85%的條件下醒發60 min；用電蒸鍋蒸25 min。

1.3.4 酵子制作單因素試驗設計

在前期確定的工藝參數基礎上，研究酵子制作所需的米酒添加量（4%、6%、8%、10%、12%）、小曲添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、大曲添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%），考察各單因素制作酵子對饅頭感官品質的影響。

1.3.5 響應面優化

選取米酒添加量（A）、小曲添加量（B）、大曲添加量（C）3個因素進行響應面優化，以Y（饅頭感官評分）為考核指標，確定最佳制作工藝條件。試驗因素水平表見表1。

表1 響應面優化試驗因素水平表Table 1 Response surface optimization experiment factor level table

1.3.6 饅頭白度的測定

采用白度儀測定饅頭白度[8]。

1.3.7 饅頭硬度的測定

采用自制硬度儀測定饅頭硬度[9]。

1.3.8 饅頭感官評價

饅頭感官評分采用感官評價[10]的方法，并略加修改，選5名經過培訓的評價員集體評分（見表2）。

表2 饅頭感官評價表Table 2 Sensory evaluation form of steamed bread

1.4 數據分析

使用單向方差分析（ANOVA），使用SPSS 24.0軟件進行統計分析。使用Duncan檢驗，P＜0.05為有統計學意義。采用EXCEL 2016作圖。采用Design Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken Design試驗設計。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同米酒添加量制作酵子對饅頭品質的影響

在大曲添加量為0.5%、小曲添加量為2%的條件下，研究米酒添加量制作酵子對饅頭品質的影響。不同米酒添加量制作酵子對饅頭白度、硬度的影響結果見圖1。

圖1 不同米酒添加量制作酵子對饅頭白度、硬度的影響Fig.1 Effect of the amount of rice wine added on the whiteness and hardness of steamed bread

米酒中富含多種氨基酸及葡萄糖、麥芽糖、低聚糖等，以及適量的有機酸、酒精、維生素[11-12]。酵子制作加入米酒的目的除提供微生物源和風味物質外，還為微生物提供主要的能源物質[13]。由圖1可以看出，隨著米酒添加量的增加，制作的酵子，蒸制出來的饅頭的白度先升高后降低再略有增加，硬度呈現先降低后升高再略有降低的趨勢。制作的酵子饅頭的硬度與白度呈現對稱關系。當米酒添加量為8%時，制作的酵子饅頭的白度顯著高于其他米酒添加量的酵子（P＜0.05），而硬度顯著低于其他米酒添加量的酵子（P＜0.05）。添加米酒量較少所制作的酵子，制作的饅頭的硬度較大，內部結構與口感較差，氣味較弱。可能由于米酒量少，酵子里面的菌群所需的營養物質也相對減少，菌群的生長也受到了抑制，使得酵子中菌群變少，產氣變弱，產生脂類、醇類、醛類等物質量也相對減少，影響到饅頭的氣味與品質。米酒添加量制作酵子對饅頭感官評價的影響見圖2。

由圖2可以看出，當米酒添加量為8%時，制作的酵子，蒸制出來的饅頭的感官評分最高，為80.8分，顯著高于其他條件的米酒變量的酵子制作的饅頭（P＜0.05）。這與米酒添加量為8%制作酵子對饅頭的硬度，白度的結果一致。米酒的添加，發揮的是多種微生物的共生優勢，主要作用機理是根霉、酵母和細菌等幾種主要微生物的酸化、糖化、酒化、酯化等過程的協同進行，形成醇、酯、醛、酚等多種風味物質，米酒發酵的微生物群落組成直接影響米酒的風味[14-15]，進而影響到酵子饅頭的風味。

圖2 不同米酒添加量制作酵子對饅頭感官評價的影響Fig.2 Effect of making rice wine on the sensory evaluation of steamed bread

2.1.2 不同小曲添加量制作酵子對饅頭品質的影響

在大曲添加量為0.5%、米酒添加量為8%的條件下，研究不同小曲添加量制作酵子對饅頭品質的影響。

小曲又叫白藥、酒餅、白曲、酒藥、藥曲、糠曲、酒曲丸等[16]。不同小曲添加量制作酵子對饅頭白度、硬度的影響結果見圖3。

圖3 不同小曲添加量制作酵子對饅頭白度、硬度的影響Fig.3 Effect of xiaoqu addition on the whiteness and hardness of steamed bread

由圖3可以看出，小曲添加量在1%～2%，制作的酵子饅頭的硬度明顯降低，白度明顯升高。小曲添加量為2%～3%時，酵子饅頭硬度與白度幾乎沒有變化。小曲添加量為3%～5%時，酵子饅頭的白度呈現先降低后升高的趨勢，硬度先升高后降低。小曲添加量為2%～3%時，制作的酵子饅頭的白度顯著高于其他小曲添加量的酵子（P＜0.05），而硬度顯著低于其他小曲添加量的酵子（P＜0.05）。小曲中的微生物主要是霉菌和酵母菌，還有一些細菌和放線菌[17]，小曲制作中添加適量的中藥可以促進霉菌、酵母菌有益菌種生長繁殖和酶的代謝，同時可以抑制雜菌生長[18]，酵子制作中添加小曲，蒸制出來的饅頭有淡淡的酒香味。小曲添加量制作酵子對饅頭感官評價的影響見圖4。

圖4 不同小曲添加量制作酵子對饅頭感官評價的影響Fig.4 Effect of xiaoqu addition on making sensory evaluation of steamed bread

由圖4可以看出，小曲添加量為2%時，饅頭的感官評分高于其他小曲添加量的酵子制作的饅頭。

2.1.3 不同大曲添加量制作酵子對饅頭品質的影響

在小曲曲添加量為2%、米酒添加量為8%的條件下，研究不同大曲添加量制作的酵子對饅頭品質的影響。大曲中的微生物主要源自原料、水、空氣、場所和谷殼、稻草等所攜帶的微生物，也有在制作過程中加入少量曲母以強化菌株，通過自然培養、富集等過程，進而形成大曲的獨特微生物菌系[19]，其中酵母菌是大曲主要的功能微生物之一[20]。大曲添加量制作酵子對饅頭白度、硬度的影響見圖5。

圖5 不同大曲添加量制作酵子對饅頭白度、硬度的影響Fig.5 Effect of daqu addition on whiteness and hardness of steamed bread

由圖5可以看出，當大曲添加量為0.5%時，制作的酵子，蒸制出來的饅頭的硬度顯著低于其他條件的大曲添加量的酵子所制作的饅頭（P＜0.05）。當大曲添加量為0.9%時，制作的酵子，蒸制出來的饅頭的白度顯著高于其他條件的大曲添加量的酵子所制作的饅頭（P＜0.05）。大曲添加量制作酵子對饅頭感官評價的影響見圖6。

圖6 不同大曲添加量制作酵子對饅頭感官評價的影響Fig.6 Effect of daqu addition on making sensory evaluation of steamed bread

由圖6可以看出，隨著大曲添加量的增加，饅頭的感官評分先增加后降低，當大曲量為0.5%，制作的酵子，蒸制出來的饅頭的感官評價顯著高于其他條件的大曲添加量的酵子所制作的饅頭（P＜0.05）。綜合考慮，大曲的添加量為0.5%時，制作的酵子品質較好。

2.2 響應面分析法優化酵子制作工藝結果分析

2.2.1 結果分析

在單因素試驗分析的基礎上，依據Box-Behnken中心組合試驗設計三因素三水平共17個試驗，響應面試驗結果見表3。

表3 Box-Behnken中心組合試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken center combination test design and results

通過表3試驗值的二次多元回歸擬合，得到感官總分（Y）響應3變量的二次多項式型：Y=80.54-4.70A-1.15B+0.45C-0.90AB-0.050AC-0.50BC-4.19A2-1.25B2+0.1C2，對此二次回歸方程進行方差分析，結果見表4。

表4 響應面設計二階回歸模型方差分析Table 4 Response surface design second-order regression model analysis of variance

從表4可知，模型的失擬項P=0.064 1＞0.05，說明回歸模型與實際試驗擬合較好，試驗誤差??；模型P＜0.000 1，說明該二次回歸方程擬合度好，方程能夠正確反映酵子饅頭感官總分與各因素之間的關系。模型的相關系數R2=0.974 7，說明預測值與試驗值有較高相關性；調整決定系數R2Adj=0.942 2，說明方程模型可信度較高，能夠較好地描述試驗結果。因此，該二次回歸方程正確反映了米酒、小曲、大曲添加量對酵子制作，所蒸制饅頭感官總分的影響。

根據表4，響應面設計二階回歸模型方差進行分析，因素F值的大小可以反映出其對試驗指標的重要性，F值越大，表明對試驗指標影響越大，即重要性越大[21]。所以，影響酵子因素主次排列順序為：米酒添加量＞小曲添加量＞大曲添加量。在本次試驗建立的模型中米酒添加量的一次項、二次項對制作酵子，所蒸制的饅頭的感官評分影響極顯著（P＜0.01）；小曲添加量的一次項、二次項對制作酵子，所蒸制的饅頭的感官評分影響顯著（P＜0.05）。而大曲一次項、米酒與小曲交互項、米酒與大曲交互項、小曲與大曲交互項、大曲二次項對感官評分影響不顯著。由此可知，各試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系[22]。

應用Design-Expert軟件對上述試驗結果進行響應面分析，可以得到該模型的響應面圖和等高線圖，結果如圖7～圖9所示。

圖7 米酒變量與小曲變量響應面及等高線圖Fig.7 The response surface and contour plots of rice wine variables and xiaoqu variables

圖8 米酒變量與大曲變量響應面及等高線圖Fig.8 The response surface and contour map of rice wine variant and daqu variable

圖9 小曲變量與大曲變量響應面及等高線圖Fig.9 The response surface and contour map of xiaoqu variable and daqu variable

等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強弱，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著[23]。通過Design-Expert軟件對試驗模型進行優化，以感官評分最高為目標，最高分為82.7分，得到最佳工藝為米酒量為6.97%、小曲量為1.52%、大曲量為0.70%。

3 結論

通過對米酒、小曲、大曲添加量3個因素進行優化試驗，利用響應面法優化酵子生產工藝。依據Box-Behnken中心組合試驗設計得到二次回歸方程：Y=80.54-4.70A-1.15B+0.45C-0.90AB-0.050AC-0.50BC-4.19A2-1.25B2+0.1C2，R2=0.974 7，方程擬合良好。優化試驗確定的最佳工藝條件為：米酒量為6.97%、小曲量為1.52%、大曲量為0.70%。在此條件下預期的制作酵子饅頭的感官總分是82.7分，實際得分為81.5±0.4分。