黑曲霉高效敲除體系構建及tpsA基因的敲除

劉玲，張鴻飛，張嵐，秦酈，王德培，3，*

（1.工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津300457；2.省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津300457；3.天津科技大學生物工程學院，天津300457）

黑曲霉（Aspergillus niger）作為一種重要的工業生產安全菌株之一，可用于有機酸、淀粉酶、酸性蛋白酶等的工業生產中。同時也被廣泛應用于醫藥，飼料生產，食品加工，廢料處理等領域[1]。因此進一步從分子方面深入研究工業菌株黑曲霉的代謝機理，可以從微觀的角度調控基因的表達，為獲得高產工業黑曲霉菌株奠定了理論基礎。目前，基因敲除是研究基因功能最為便捷準確的分子生物學改造手段之一，主要應用于對已知DNA序列的基因功能和基因調控機理研究。基因敲除以基因同源重組技術為基礎，通過構建帶有同源重組的DNA片段的基因敲除載體，將其轉化入目的細胞中，部分或者完全取代原始基因組中的等位基因，通過對突變體表型的分析從而反向研究基因功能的方法[2]。

工業黑曲霉基因敲除體系依賴于根癌農桿菌介導的黑曲霉轉化體系（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT），該轉化體系的條件優化已經完成，大大減少了絲狀真菌的轉化操作，提高了載體上的同源DNA片段的插入效率[3]。農桿菌介導轉化法雖然能大幅度地提高同源重組片段的轉化效率，但是由于T-DNA自身會隨機整合到基因組中，攜帶同樣的抗性標記造成假陽性率高，從而使篩選同源雙交換產生的基因敲除陽性轉化子工作的難度增大。另一方面，等位基因同源重組的效率相對T-DNA隨機插入的效率低很多，造成基因敲除陽性轉化子的數量遠遠少于隨機插入的轉化子的數量，因此需要篩選大量轉化子才能得到正確的基因敲除轉化子。單純皰疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine kinase，HSVtk）可在絲狀真菌中表達，將培養基中的特定化合物5-氟脫氧尿苷（5-fluoro-2'-deoxyuridine，F2dU）轉變為真菌的毒性物質，導致真菌致死[4]，因此，可在TDNA的同源重組DNA片段上游插入致死基因HSVtk基因序列，從而減少黑曲霉假陽性轉化子，提高正確基因敲除菌株的比例，從而提高篩選效率。

海藻糖是由兩個葡萄糖分子以1，1-糖苷鍵構成的非還原性二糖，其代謝的前體物質為6-磷酸海藻糖。6-磷酸海藻糖主要是由尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖經海藻糖6-磷酸合成酶催化合成6-磷酸海藻糖。6-磷酸海藻糖是6-磷酸葡萄糖分支代謝流的重要物質，顯著影響6-磷酸葡萄糖合成檸檬酸的轉化效率，因此敲除海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，tpsA），可以調控碳源在主代謝流的積累量，從而提高黑曲霉的檸檬酸產量。本文首先構建具有致死基因HSVtk的工程菌株，獲得致死篩選濃度為10 μmol/L 5-氟脫氧尿苷，然后構建具有單純皰疹病毒胸苷激酶和潮霉素雙標記以敲除tpsA質粒，通過反向篩選，減少假陽性率，高效獲得tpsA同源重組敲除菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株，質粒和引物

試驗所用菌株和質粒見表1。試驗中用到的引物見表2。

表1 試驗所用的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in test

表2 試驗中用到引物Table 2 The primers used in test

續表2 試驗中用到引物Continue table 2 The primers used in test

1.1.2 培養基

肉湯（Luria-Bertani，LB）培養基用于大腸桿菌和農桿菌液體培養，完全培養基（complete medium，CM）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基用于黑曲霉的培養，配制方法參照文獻[5]。誘導培養基（induction medium，IM），農桿菌侵染所需培養基及試劑參考文獻[6]配制。

1.2 試劑與溶液的配制

Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、Prime STAR HS DNA聚合酶（2.5 U/μL）、RNaseA（5 mg/mL）、T4 DNA 連接酶（10 U/μL）、DL5000 DNA Maker、DL10000 DNA Maker、限制性內切酶 EcoRI（15 U/μL）、SalI（15 U/μL）、KpnI（10 U/μL）：TaKaRa公司；5-氟脫氧尿苷、潮霉素 B、乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）：Solarbio公司；其他試劑：天津市北方天醫化學試劑廠。

潮霉素B（hygromycin）：潮霉素B 100 mg，ddH2O定容至1 mL。母液濃度為100 mg/mL，工作濃度為200 μg/mL。

1.3 根癌農桿菌介導的黑曲霉轉化體系

將實驗室保存的質粒p80-HSVtk通過電轉化的方法，導入根癌農桿菌Agrobacterium tumefaciens（AGL1）中，再利用農桿菌AGL1介導侵染黑曲霉，完成黑曲霉的遺傳轉化，具體操作方法參見曹張磊等[3]的方法進行。

1.4 黑曲霉對F2dU的敏感性實驗

為確定黑曲霉是否適用于5-氟脫氧尿苷參與下的反向篩選體系，進行黑曲霉對F2dU的敏感性實驗。將質粒p80-HSVtk電轉化進農桿菌AGL1中，使用攜帶質粒p80-HSVtk的農桿菌介導侵染原始菌株黑曲霉10142，從而獲得一株含有致死基因HSVtk的隨機插入黑曲霉轉化子7-1。取200 μL濃度均為1.3×106個/mL的突變株7-1和原始菌株的孢子懸液分別涂布于 F2dU 終濃度為 0、10、25、50、150、300 μmol/L的CM培養基中，35℃靜置培養5 d，觀察結果。

1.5 敲除質粒p81的構建

海藻糖-6-磷酸合成酶（tpsA）基因的同源重組敲除片段的構建使用了融合PCR的方法，將同源重組左右臂，潮霉素抗性標記以及致死基因用常規PCR分別擴增后，融合成為tpsA基因敲除框，酶切連接完成p81質粒的構建。首先以p44質粒為模板，以HYG-F/HYG-R為引物（本文所用引物堿基序列見表2），常規PCR反應擴增1.4 kb的潮霉素抗性片段。同時以pBHt2-tk質粒為模板，以HSVtk-F/HSVtk-R為上下游引物，PCR擴增1.8 kb的HSVtk基因片段。以黑曲霉基因組為模板，以1F/1R和2F/2R為引物，PCR擴增長度均為1 kb左右的tpsA基因同源重組左右臂片段。其中引物1F的5’端含有與HSVtk-R互為反向互補的接頭序列，引物2F的5’端含有與HYG-R互為反向互補的接頭序列。從而獲得末端含有相應互為反向互補序列的4個PCR產物。使用融合PCR的方法擴增2.8 kb的HSVtk和同源左臂的融合片段，使用限制性內切酶KpnI和EcoRI雙酶切連接的方法將此片段連接到質粒p40中。同樣的方法，使用限制性內切酶KpnI和SalI將HYG和同源右臂的融合片段雙酶切連接到過程質粒p40-HSVtk-L中。從而完成敲除質粒p81的構建。

1.6 tpsA基因敲除陽性菌株的篩選驗證

將農桿菌AGL1介導侵染黑曲霉后的孢子，涂布于濃度為200 mg/mL的潮霉素B的抗性平板上，待長出單菌落點接到10 μmol/L濃度的F2dU平板中，35℃培養5天后，挑出能正常生長菌株即可能的同源重組陽性轉化子，提取基因組并利用PCR的方法進行分子生物學驗證。

2 結果與討論

2.1 F2dU的篩選濃度的確定

為了確定F2dU的篩選濃度，必須獲得一株含有HSVtk基因的黑曲霉隨機插入轉化子。將質粒p80-HSVtk電轉化進農桿菌AGL1中，使用攜帶質粒p80-HSVtk的農桿菌介導侵染原始菌株黑曲霉10142，通過潮霉素抗性篩選獲得一株含有致死基因HSVtk的隨機插入黑曲霉轉化子7-1。在F2dU終濃度分別為0、10、25、50、150、300 μmol/L 的 CM 平板上，觀察突變株7-1和原始菌株對F2dU的敏感性。觀察結果如圖1所示。

含有HSVtk基因的黑曲霉轉化子在濃度為10 μmol/L的F2dU的CM平板上，孢子完全無法萌發。因此選用10 μmol/L的F2dU當作轉化子的篩選濃度即可抑制含HSVtk的T-DNA隨機插入轉化子的生長，從而大大減少篩選操作，提高陽性轉化子的比例。同時原始菌株在含有10 μmol/L F2dU的CM平板上生長并不受到影響。證明該反向篩選方法可減少隨機插入轉化子的概率，提高黑曲霉原位同源重組轉化子的篩選效率。

圖1 黑曲霉7-1和原始菌株在含有不同濃度F2dU的CM培養基上培養3 d的生長情況Fig.1 The growth of 7-1 and A.niger 10142 on CM plates with the different F2dU concentrations after 3 d

2.2 tpsA基因敲除質粒的成功構建

通過常規PCR反應，得到長度分別為1.8、1.0、1.4、1.0 kb的HSVtk基因片段，同源重組左臂片段，HYG基因片段和同源重組右臂片段。利用融合PCR，將HSVtk基因和同源左臂這2個DNA片段末端反向互補序列相互結合，構建2.8 kb的HSVtk和同源左臂的融合片段，同樣的方法，得到2.4 kb的HYG和同源右臂的融合片段。先通過KpnI和EcoRI處理質粒p40和2.8 kb的融合片段，再過夜連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選陽性轉化子后得到過程質粒p40-HSVtk-L。再使用同樣的方法，使用KpnI和SalI將2.4 kb的融合片段連接到過程質粒p40-HSVtk-L中，完成敲除質粒p81的構建，見圖2。

圖2 tpsA基因敲除質粒p81構建Fig.2 The construction of plasmid p81

2.3 tpsA基因敲除菌株的構建

將構建好的p81tpsA基因敲除質粒，轉化入大腸桿菌感受態細胞中。大腸桿菌菌落PCR驗證正確后提取質粒，具體質粒提取方法參見天根質粒回收試劑盒說明書。接著將質粒電轉入農桿菌感受態細胞中，菌落PCR驗證正確后，準備農桿菌侵染黑曲霉實驗。通過根癌農桿菌介導的黑曲霉轉化實驗，完成黑曲霉的遺傳轉化。挑選在10 μmol/L F2dU的CM平板上仍能正常生長的16個tpsA基因敲除轉化子，提取轉化子基因組后對其進行分子生物學驗證。瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3（a）所示。以質粒p81為陽性對照，以原始基因組為陰性對照。使用引物1F/2R分別能擴增出3.5 kb和2.8 kb的DNA條帶。以轉化子的基因組為模板，同樣使用 1F/2R 引物，其中（2、4、5、6、7、10、11、13、14、16號泳道）轉化子能擴增出3.5 kb的單一條帶，沒有原始基因組的2.8 kb的條帶，說明這10個轉化子的tpsA基因編碼框內的700 bp已經被1.4 kb的潮霉素抗性片段同源重組雙交換所替代，從而破壞tpsA基因，為正確的同源重組雙交換敲除菌株。其余6個轉化子中，有4個泳道的轉化子瓊脂糖凝膠電泳圖顯示為2.8 kb包含原始菌株tpsA基因的ORF區和3.5 kb的T-DNA中隨機插入的敲除框片段的雙電泳條帶，為T-DNA隨機插入的黑曲霉轉化子；剩下兩個為原始基因的2.8 kb的單一條帶。統計數據，tpsA基因敲除轉化子在總轉化子中比例為63%。PCR初步驗證正確的轉化子，對其進行左臂更左片段和右臂更右片段的擴增。使用3F/HYG-R引物，以轉化子的基因組為模板，對其進行左臂更左片段的擴增，如圖3（b）所示。擴增出了與預期結果相符的3 000 bp的片段。同樣使用HYG-F/3R引物，對轉化子進行右臂更右片段的擴增，結果如圖3（c）所示。結合圖 3（b）和圖 3（c）的瓊脂糖凝膠電泳圖的結果，說明轉化子均為原位同源重組雙交換的敲除菌株。成功構建tpsA基因的敲除菌株Aspergillus niger101-ZM19，基因敲除流程圖如圖4所示。

圖3 黑曲霉tpsA基因敲除轉化子的分子生物學驗證Fig.3 Verification of A.niger transformants

圖4 基因敲除流程圖Fig.4 The schematic of tpsA gene replacement in A.niger

2.4 搖瓶發酵驗證敲除突變株的有機酸產量

海藻糖合成酶中的tpsA與海藻糖合成有關，tpsA通過抑制己糖激酶的活性來控制葡萄糖流向糖酵解通路。葡萄糖進入細胞以后，首先經己糖激酶催化，生成6-磷酸葡萄糖。tpsA基因被敲除時，己糖激酶的活性不再受抑制，磷酸化的己糖將大量積累，促進葡萄糖大量流向糖酵解途徑和三羧酸循環，從而有利于菌體代謝產酸，提高黑曲霉敲除突變株的有機酸產量。

使用帶渣玉米液化液進行黑曲霉的搖瓶發酵實驗，控制初始還原糖含量在16%，500 mL三角瓶的玉米液化液的裝液量為50 mL，突變株和原始黑曲霉孢子接種量均為105個/mL，280 r/min，35℃發酵72小時后測發酵液中的有機酸含量。使用酸堿滴定的方法，測得突變株的有機酸含量比原始菌株提高了6.8%，產酸結果如圖5所示。

圖5 黑曲霉轉化子72 h搖床產酸驗證Fig.5 The shaking acid of Aspergillus niger transformants

3 結論與討論

黑曲霉作為工業生產有機酸和酶制劑的重要菌株，其基因功能研究對于未來菌株的分子生物學改造具有指導性意義。基因敲除是研究基因功能最直接、有效的技術手段。黑曲霉作為真核生物，其基因敲除轉化子的篩選難度較大，正確突變株的概率較低，因此一個高效黑曲霉基因敲除體系的成功構建會加快黑曲霉基因工程改造的速度[7]。本文利用HSVtk基因在黑曲霉中表達，導致其具有F2dU培養物中致死的特性，構建在同源重組上游序列T-DNA插入HSVtk基因，使非同源重組轉化子在含F2dU培養基中致死，從而大大減少假陽性轉化子的數量，提高同源重組敲除突變株的篩選效率。

文獻報道可知，稻瘟病菌和尖孢鐮刀菌對F2dU不敏感，當HSVtk基因的隨機插入基因組后，在含有濃度為0.5 μmol/L的F2dU培養基中即可導致稻瘟病菌和尖孢鐮刀菌的隨機插入轉化子致死[8]。本試驗發現黑曲霉CGMCC10142菌株隨機插入HSVtk基因，其轉化子在F2dU終濃度為10 μmol/L時，表現出致死特征。表明不同絲狀真菌對外源基因的表達存在較大差異，因此，不同真菌隨機插入HSVtk基因轉化子對F2dU的敏感性不同，必須進行目標菌株對F2dU的敏感性試驗，以及轉化HSVtk基因后對F2dU的敏感濃度。

本試驗黑曲霉CGMCC10142孢子對F2dU的不敏感性，在300 μmol/L的F2dU的篩選濃度下仍有50%以上的萌發率，隨機插入HSVtk基因轉化子7-1顯著提高了F2dU的敏感性，致死濃度降低到10 μmol/L，且致死率為100%。因此可以將HSVtk基因連接于敲除框的上游或下游，不易發生缺失的T-DNA區段，從而獲得黑曲霉的高效基因敲除體系。本文通過應用該體系對黑曲霉tpsA基因的敲除，正確的基因敲除突變株在總轉化子中的比例達到63%，大大提高了陽性轉化子的篩選概率，表明該體系可高效敲除黑曲霉基因。

對于轉化子的驗證，本試驗除了驗證敲除框的完整性，也驗證了敲除框同源重組的位置。在同源雙交換的左臂更左70 bp和右臂更右80 bp分別設計引物進行驗證，從而將PCR驗證轉化子的正確性提高到100%，得到一株tpsA基因敲除突變株A.niger 101-ZM19。對其進行生長形態觀察及碳源利用效率的研究，發現其特性與出發菌株基本保持一致，沒有明顯變化。有研究者發現，在植物中tpsA基因主要控制海藻糖的合成，從而提高植物的抗逆性能[8-9]。而在絲狀真菌中實現tpsA基因敲除后，其分生孢子的耐熱性能降低，但其生長特性及對葡萄糖的利用速率幾乎沒有改變[10]。同時，黑曲霉tpsA基因敲除菌的檸檬酸積累時間會提前[11]。因此對于黑曲霉tpsA基因的敲除菌A.niger 101-ZM19的產酸性能進行研究，發現其產酸性能得到提高，相對于出發菌株的檸檬酸產量提高了6.8%。