大蒜多糖對急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群失調的影響

范穎，趙鑫，李娜，吳曼曼，李新莉，*

（1.大連醫科大學臨床技能中心，遼寧大連116044；2.大連醫科大學生物技術系，遼寧大連116044）

酒精性肝損傷是酒精攝入過量（急性）或長期酗酒（慢性）導致的中毒性肝病[1]，影響著全世界數百萬人口，是導致發病率和死亡率的主要原因[2]。肝臟與腸道之間存在“腸——肝”軸[3]，在肝損傷的發生發展機制研究中，腸道菌群發揮著重要作用，腸道與肝損傷之間的相互促進相互影響的關系也逐漸被闡明。如腸道菌群參與酒精的代謝，將乙醇轉化為有毒性的、高濃度的乙醛，導致腸道的通透性增加，打破了腸道菌群的平衡，革蘭陰性菌過度生長，產生的內毒素誘導腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α），激活誘導型一氧化氮合酶系統（inducible nitric oxide synthase system，iNOS），加重了腸道的炎癥反應，而NO的大量合成又促進了肝臟的氧化應激反應，造成肝臟的進一步損傷[4]。過量飲酒導致的腸道菌群失調，成為酒精性肝病的潛在發病機制，而腸道菌群失調造成內毒素升高也是造成肝臟損傷的重要發病原因。蔡夏夏等[5]研究表明酒精性肝損傷動物腸道菌群改變，出現肝臟脂肪變性及腸道上皮細胞屏障功能障礙等，通過補充天然活性成分能夠刺激雙歧桿菌等益生菌的生長，具有益生元的作用。Chen等[6]發現肝損傷患者服用乳糖醇可以增加乳酸桿菌和雙歧桿菌，抑制條件致病菌的生長而減少內毒素的產生。因此益生菌和益生元具有減輕肝臟的損傷，改善肝臟功能的作用。

大蒜（Allium Sativum L.）為百合科蔥屬植物的鱗莖，是生活中常用的香辛料和調味品，其主要活性成分為大蒜素和大蒜多糖（garlic polysaccharide，Gp）。大蒜素具有抗菌、調血脂、降血糖、抗腫瘤、抗衰老等功能[7]，且對酒精性肝損傷具有保護作用[8]。大蒜多糖來源于大蒜素提取之后的殘渣，具有抗病毒、抗氧化、護肝、提高機體免疫力、促進神經細胞生長等作用[9]。

人體腸道細菌以厭氧菌為主，傳統的微生物技術僅能反映腸道菌群數目變化這一指標，更有超過70%的腸道菌群無法通過傳統的細菌培養方法進行培養和鑒定，不能反映腸道菌群結構的多樣性和種群變化，因此，腸桿菌基因間重復共有序列基因擴增（enter obacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）和聚合酶鏈式反應——變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）等分子生物學方法被廣泛用于菌群結構及種群變化，具有靈敏度高、可重復性、可靠性好，省時省力等優點。

用大蒜多糖對小鼠預防給藥30 d，使用56°紅星二鍋頭灌胃小鼠建立急性酒精性肝損傷模型，ERICPCR和PCR-DGGE技術研究大蒜多糖對急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群的影響，分析腸道菌群結構的相似性和多樣性，鑒定優勢菌屬序列。以腸道菌群作為治療酒精性肝病的潛在作用靶點，初步探討大蒜多糖預防酒精性肝損傷的可能作用機制，為進一步開發保肝護肝藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大蒜：市售；護肝片：長春海外制藥集團有限公司，批號：Z22020994，規格：0.35g；北京 56°紅星二鍋頭：北京紅星股份有限公司；糞便細菌DNA提取試劑盒：成都福際生物技術有限公司；GC-341f（5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG）、518r（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG）、ERIC-1（ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC）、ERIC-2（AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG）：英濰捷基上海貿易有限公司；PCR-Mix：大連優萌威貿易有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）：大連羽銘生物科技有限公司；DL2000 Marker、DL100 Marker：大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

UVS-1渦旋振蕩器：北京優晟科技有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機（離心半徑6 cm）：安徽中科中佳科學有限公司；JY-spat瓊脂糖水平電泳儀、DGGE電泳儀：大連競邁設備有限公司。

1.3 大蒜多糖的制備

200 g新鮮大蒜提取大蒜素后的殘渣，按料液比1 ∶4（g/mL）加入水 800 mL，80℃水浴 2 h，雙層紗布過濾，濾液使用旋轉蒸發儀減壓濃縮至300 mL，加入無水乙醇使其終濃度為70%，4℃過夜，5 000 r/min離心15 min得到白色沉淀，冷凍干燥即得大蒜多糖（Gp）。

1.4 模型建立與分組

SPF級KM小鼠，雌雄各半，體重18 g～22 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（遼）2013-0002，本實驗通過大連醫科大學倫理委員會同意。護肝片和大蒜多糖分別溶于生理鹽水配成護肝片溶液（6 mg/mL）、大蒜多糖高濃度（25 mg/mL）和低濃度（15 mg/mL）溶液[10]。小鼠隨機分為正常對照組（N）、急性肝損傷組（A）、護肝片組（P）、大蒜多糖高（GpH）、低濃度組（GpL），每組8只。除N組和A組，其余各組灌服0.2 mL相應藥物30 d，末次給藥30分鐘后，正常對照組灌服生理鹽水，其他組灌胃14 mL/kg紅星二鍋頭建立急性酒精性肝損傷模型，12小時后取每只小鼠糞便，于80℃保存。

1.5 糞便細菌DNA提取

使用試劑盒提取每只小鼠糞便細菌DNA，按說明書進行操作。

1.6 ERIC-PCR擴增

使用ERIC-PCR上、下游引物ERIC-1和ERIC-2，擴增體系（25μL）為：2×EasyTaqPCRSuperMix 12.5 μL，10 μmol/L 的上下游引物各 0.5 μL，DNA 模板 2 μL，去離子水補充至25 μL。PCR程序：預變性94℃5 min；變性94℃50 s，退火49℃ 30 s，46℃ 30 s，延伸72℃3 min，35個循環；充分延伸72℃9 min。PCR擴增產品用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以2 000 bp Marker為參照。

1.7PCR-DGGE電泳

使用16S rRNA基因V3可變區上、下游引物GC-341f和518r，擴增體系同1.5。PCR程序：預變性94℃5 min；變性 94 ℃ 30 s，退火 54 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，30個循環；充分延伸72℃7 min。采用8%丙烯酰胺凝膠配制25%～50%DGGE變性梯度凝膠 [其中100%濃度變性梯度凝膠含40%（體積分數）去離子甲酰胺和7 mol/L尿素]，取10 μL PCR產物于DGGE膠，60℃、70 V電泳5 h，電泳后取出凝膠使用0.125‰EB染色，拍照。

1.8 差別條帶序列分析

切下PCR-DGGE圖譜中的優勢條帶，加入20 μL無菌水搗碎，于95℃浸泡10 min，37℃過夜，取上清液做模板進行PCR擴增，引物為341f和518r，PCR反應體系和程序同1.6。PCR產物經測序，結果在GenBank數據庫中進行Blast對比分析。

1.9 統計學處理

采用Quantity One 4.6.2軟件分析ERIC-PCR圖譜中主要條帶的分子量，對PCR-DGGE圖譜進行UPGMA相似性聚類分析和多樣性分析，所得數據應用SPSS 10.0軟件包處理，正態計量指標采用均數±標準差（±SD）表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P值＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 EIRC-PCR圖譜分析

大蒜多糖對小鼠進行預防給藥30天后建立急性酒精性肝損傷模型，腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜如圖1所示。

圖1 小鼠腸道菌群ERIC-PCR圖譜Fig.1 ERIC-PCR profiles of intestinal microflora in mice

正常對照組（N）條帶較多，以小片段居多，3條主要條帶集中在360、430 bp和610 bp附近。急性酒精性肝損傷組（A）以360 bp的條帶為優勢條帶，而610 bp左右的條帶強度減弱。與正常對照組相比，大蒜多糖和護肝片給藥組（GpH，GpL，P），小鼠腸道中條帶數量基本不變，但是320 bp左右的條帶強度明顯增大，610 bp左右的條帶強度有減小的趨勢。與急性肝損傷組相比，大蒜多糖和護肝片給藥組（GpH，GpL，P）小鼠腸道中360 bp左右的條帶強度明顯減小。以上研究結果表明酒精建立急性肝損傷模型小鼠腸道菌群結構發生明顯改變，320、360 bp和610 bp左右的條帶為大蒜多糖預防給藥組、護肝片組和急性酒精性肝損傷組小鼠腸道中的特征條帶。

2.2 PCR-DGGE圖譜分析

大蒜多糖對小鼠預防給藥30天后使用紅星二鍋頭建立酒精性肝損傷小鼠模型，腸道菌群DGGE圖譜如圖2所示。

圖2 小鼠腸道菌群DGGE圖譜和UPGMA相似性聚類分析Fig.2 Representative DGGE profiles（A）and UPGMA dendrograms（B）of intestinal microflora

同一位置的條帶代表相同的優勢細菌，條帶亮度則反映出這一細菌的相對含量。實驗組各泳道條帶較多，亮度較強，表明小鼠腸道菌群的種類和數量較多，腸道菌群結構的豐富度和多樣性較高。條帶a、b、c、e存在于各組樣品中為共有條帶，說明其所代表的細菌是小鼠腸道中的優勢菌群，其中條帶a所代表的細菌在正常對照組和大蒜多糖高劑量組中含量最大。條帶d在GpH泳道中強度高，含量大，而在其他實驗組中含量明顯降低，這表明d所代表的細菌是大蒜多糖高劑量組小鼠與其他組小鼠腸道差異菌群。UPGMA分析DGGE圖的相似性，結果顯示各組小鼠腸道菌群結構聚成兩大簇，急性酒精性肝損傷組（A）單獨聚成一簇，其他組聚成另一簇，兩大簇之間相似性較低，僅為0.62，表明酒精導致急性肝損傷的同時對小鼠腸道菌群結構造成影響。正常對照組（N）和大蒜多糖高劑量組（GpH）小鼠腸道菌群結構的相似性較高，為0.81，護肝片組（P）小鼠腸道菌群結構與上述兩組也具有較高的相似性，為0.75，這說明護肝片和高劑量大蒜多糖對小鼠腸道菌群結構的影響相似。

2.3 不同給藥組小鼠腸道菌群多樣性分析

大蒜多糖預防給藥小鼠腸道菌群結構多樣性分析如表1所示。

Shannon-Weaver多樣性指數（H’）比較不同給藥組小鼠腸道菌群結構的多樣性差異，H’指數越大，群落所含的信息量也就越大，均勻度Evenness（E）指數分析菌群分布情況。H’和E由以下公式獲得：H’=-∑（pi）（lnpi），E=H’/lnS，pi=ni/∑ni，ni是條帶灰度值[11]，pi為第i條帶的灰度值與該泳道所有條帶灰度值總和的比值，S為條帶數，H’為多樣性指數，E為均勻度指數。與正常對照組相比，急性酒精性肝損傷組小鼠腸道菌群條帶數目增多，豐富度指數S顯著增大（P＜0.01），推測酒精攝入導致腸道內某種細菌增多。急性酒精性肝損傷組小鼠腸道菌群結構的多樣性指數H’和均勻度指數E與正常對照組相比顯著減?。≒＜0.01），正常對照組、護肝片組和大蒜多糖高低劑量組菌群結構多樣性指數H’和均勻度指數E與急性酒精性肝損傷組相比顯著增大（P＜0.05），以上實驗結果表明，酒精的攝入對腸道菌群結構有明顯影響，導致菌群多樣性降低，菌群失調。其中，大蒜多糖高劑量組的多樣性指數和均勻度指數最高，其DGGE圖譜所反映的信息量最大。

表1 不同給藥組小鼠腸道菌群多樣性分析（±SD，n=8）Table 1 Microflora diversity indexes analysis of different groups（±SD，n=8）

表1 不同給藥組小鼠腸道菌群多樣性分析（±SD，n=8）Table 1 Microflora diversity indexes analysis of different groups（±SD，n=8）

注：與急性酒精性肝損傷組小鼠腸道菌群結構相比，*P＜0.05顯著性差異，**P＜0.01極顯著性差異，與正常對照組相比較，##P＜0.01極顯著性差異。

組別 S值 H’值 E值正常對照組 10.75±0.96* 2.247 1±0.033 4* 0.946 1±0.024 1**急性酒精性肝損傷組 13.25±1.50# 1.812 8±0.139 4## 0.70 5±0.010 1##護肝片組 12.75±1.50 2.364 5±0.072 4* 0.928 7±0.023 1**大蒜多糖高濃度組 12.50±0.58 2.594 3±0.013 2** 1.027 0±0.020 7**大蒜多糖低濃度組 11.75±0.96* 2.213 1±0.040 1* 0.898 2±0.011 2*

2.4 差異條帶序列分析

DGGE圖譜優勢條帶測序結果在GenBank中用Blast進行檢索和同源性比較，如表2所示。糞便細菌與數據庫已知細菌序列的相似性均在93%以上。

由表2可知，菌a和Eubacterium plexicaudatum的相似性為94%，為優桿菌屬（Eubacterium）細菌；菌b與維氏氣單胞菌的相似性為93%；菌c與梭菌屬的相似性為97%；菌d與Lactobacillus equicursoris的相似性為96%，為乳酸菌屬（Lactobacillus）；菌e與Enterococcus sulfureus的相似性為97%。以上研究結果可知，急性酒精性肝損傷的小鼠腸道菌群失調，糞便標本中優桿菌屬和乳酸菌屬細菌明顯減少，而高劑量的大蒜多糖組，優桿菌屬和乳酸菌屬含量均增大。

表2 DGGE圖譜中優勢條帶測序與參比序列對照結果Table 2 Comparative results of dominant band sequence and reference sequence in DGGE profile

3 結論與討論

ERIC-PCR圖譜表明正常對照小鼠腸道中菌群條帶主要集中在360、430 bp和610 bp附近。急性酒精性肝損傷組小鼠腸道中以360 bp的條帶為優勢條帶，而610 bp左右的條帶強度減弱，大蒜多糖和陽性藥護肝片組320 bp左右的條帶強度均有明顯增大，360 bp左右的條帶強度減小。因此，推測320、360 bp和610 bp左右的條帶為急性酒精性肝損傷組和大蒜多糖干預組小鼠腸道中的特征條帶。320 bp和360 bp等特征條帶的確定，可作為后續篩選治療酒精性肝損傷藥物的切入點。ERIC-PCR技術可以快速、靈敏地從分子水平比較分析微生物群落的結構，從而實現對調節腸道菌群藥物的篩選，可是因為其通過DNA分子量來分離目標條帶，可能相同條帶包括多種細菌，ERIC-PCR只能簡單判斷樣品中微生物的分布趨勢。為明確腸道菌群優勢條帶的序列及菌群結構的整體差異，基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技術被應用于研究大蒜多糖對急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群失調的影響，為開發利用大蒜多糖的生物活性提供一個新方向。本實驗結果表明大蒜多糖預防給藥能夠增加腸道中優桿菌屬和乳酸菌屬細菌的數量，腸道菌群結構的多樣性和均勻度指數均增大。優桿菌是人和動物口腔與腸道正常菌群的成員，對機體有營養生物拮抗和維持腸道微生物生態學平衡等功能[12]。乳酸桿菌也是人體腸道中正常的優勢菌群，黏附于腸上皮細胞表面，在維持人體腸道微生態平衡、增強機體免疫力、降解有毒物質、激活免疫應答等方面發揮著重要作用，且能夠促進宿主的消化、吸收和腸胃功能[13]。大蒜多糖促進這兩種腸道有益細菌的生長，對小鼠腸道菌群結構具有很好的保護作用。

綜上，由于“腸——肝”軸的存在，腸道菌群在肝損傷的發生發展中發揮著重要作用，很多改善肝臟功能的天然產物都具有調節腸道菌群平衡的作用。本研究利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技術分析大蒜多糖對酒精性肝損傷小鼠腸道菌群的影響，發現急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群組成結構發生改變，大蒜多糖預防給藥能夠增加小鼠腸道中優桿菌屬和乳酸菌屬等益生菌數量，對急性酒精性肝損傷伴有的腸道菌群失調具有一定的預防作用。本課題為大蒜多糖預防酒精性肝損傷伴有的腸道菌群失調提供實驗依據，為深入研究腸道菌群在酒精性肝損傷發生發展中的作用奠定基礎，為以腸道菌群作為篩選治療酒精性肝病藥物的新靶點提供思路與途徑。