一個水稻苗期白化致死突變體asl6的鑒定及其基因定位

雷曉慶, 吳蘭蘭, 王文娟, 林冬枝,2, 董彥君,2*

(1.上海師范大學 生命與環境科學學院,上海 200234; 2.上海師范大學 遺傳研究所,上海 200234)

0 引 言

水稻的栽培歷史悠久,中國約有一半人口以水稻為主食[1],因此研究如何提高水稻的產量來解決日益嚴峻的糧食問題非常重要.水稻經光合作用進行干物質積累,葉綠體在很大程度上決定了光合作用的效率[2].葉綠體是植物進行光合作用的場所,是半自主性細胞器[3],由葉片分生組織細胞中的前質體在相關的核、質基因共同調控下生成[4-6].自然或非自然因素都會導致與葉綠素合成或葉綠體發育相關的基因發生突變,造成葉綠素合成或降解受阻,葉綠體發育缺陷,最終引起葉色的變化,甚至導致整個植株死亡[7].已知水稻的一些白化突變體從發芽至三葉期均呈白化表型,最終無法光合作用而死亡,相關的基因也得到了初步的定位.程世超等[8]報道的水稻白化致死突變體abl4的突變基因位于第4染色體;余慶波等[9]將水稻白化致死突變體alb21的突變基因定位在第3染色體,并發現其葉綠體中只有一些空泡狀結構;朱環環等[10]將水稻白化致死突變體abl25,定位于第2染色體;夏久成等[11]將一個返綠的白化突變基因al12,定位在第8 染色體上;潘江杰等[12]通過對白化致死突變體ABD研究,將ABD基因定位在第7染色體,發現一個關于類胡蘿卜素相關基因編碼區上的G變成了A,氨基酸從野生型P(脯氨酸)突變成了L(亮氨酸),導致突變體表型白化.另外,本實驗室也報道了4個水稻白化突變基因asl1,asl2,asl3 和asl4,其中asl1[13]和asl2[14]是核糖體白蛋白編碼基因突變引起,asl3是編碼三角狀五肽重復結構域(Pentatricopeptide repeat,PPR)蛋白基因突變引起[15],白化致死突變體asl4,定位于第2染色體[16].本研究發現并鑒定了一個水稻苗期白化致死突變體asl6(albinoseedlinglethality6),其表型不受溫度影響;對其葉色、葉綠素含量、葉綠體超微結構進行觀察分析,并利用簡單重復序列(SSR)及InDel 分子標記對該突變基因進行了定位,為該基因的分子克隆及其作用機理的研究奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材 料

突變體asl6從粳稻“嘉花1號”干種子經60Coγ射線輻照后代獲得.“嘉花1號”干種子經過輻照之后,突變體進行自交選取苗期分離出白化表型的株系(上一代為雜合單株),隨機選取生長正常的單株掛牌,收獲掛牌的單株種子播種,根據后代分離情況確定上一代的基因型,棄純合野生型單株,保留雜合單株.

1.2 方 法

1.2.1 突變體的表型觀察

為了進一步確定突變體asl6的表型,將突變體雜合子及其野生(WT)型“嘉花1號”的種子在32 ℃條件下催芽3 d后,分別播種在裝有水稻土的塑料盆內,因為有很多溫敏感的突變體被報道,為排除這種溫度差異,將它們分別放置在25 ℃和32 ℃的光照培養箱(GXZ智能型)內,模擬水稻生長的自然條件,每日光照12 h,光照強度為180 μmol·m-2·s-1,適時觀察幼苗葉色變化,并對其進行拍照.

1.2.2 葉片光合色素含量的測定

突變體asl6與野生型“嘉花1號”長至三葉期時,按張憲政的方法[17]測定其葉片光合色素含量.具體為取野生型“嘉花1號”和突變體的三葉期的葉片,剪其第三葉片中間區域,稱取20 mg,將其剪碎,并放入5 mL的離心管中,加5 mL葉綠素提取液(體積比:V乙醇∶V丙酮∶V水=5∶4∶1)并輕輕搖勻,將其放置在室溫、黑暗的環境中處理18 h,直到葉片的綠色全部溶解到提取液中.利用METASH-UV5100分光光度計分別測定470 nm(葉綠素a最高吸收波長)、645 nm(葉綠素b最高吸收波長)、663 nm(葉綠素類胡蘿卜素最高吸收波長)波長下的吸光值,重復3次,取其均值.

1.2.3 葉綠體顯微結構觀察

葉片取樣與上述相同葉片,隨后延葉脈方向剪成面積為1 mm2的小正方形,立即放入2.5%(質量分數)戊二醛固定液(V1∶V2∶V3=1∶4∶5,V1,V2,V3分別為質量分數為2.5%的戊二醛,濃度為0.2 mol·L-1的磷酸緩沖液和無菌水)中,24 h后換新鮮固定液,4 ℃保存.固定之后,進行清洗、再固定、洗滌、脫水與硬化、置換、浸漬、包埋、聚合、修塊、切片、染色等一系列處理,再用透射電鏡(Hitachi765型)進行觀察拍照.

1.2.4 遺傳分析和定位群體的構建

突變體雜合子與“培矮64S”雜交獲得F1種子,收獲單株種子播種,根據后代分離情況確定上一代的基因型,只保留雜合基因型,自交獲得能用于遺傳分析F2代群體,選取表現為白化表型的單株用于初定位.

1.2.5 水稻DNA的提取

采用TPS (tris physiological saline) 法[18]以及十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[19],提取親本以及F2代遺傳群體基因組 DNA.

1.2.6 基因定位

本研究中,首先利用本實驗室篩選的“嘉花1號”和“培矮64S”多態性DNA分子標記,隨機挑選F2中分離出的22株突變表型白化苗作連鎖分析,確定突變基因在哪條染色體上,然后,進一步擴大F2群體進行基因定位,并應用 MAPMAKER/EXP 3.0軟件,構建目的基因區域的遺傳圖譜.在目標區域內通過NCBI公布的粳稻日本晴和秈稻9311基因組序列的InDel位點,利用Primer Premier 5.0 軟件設計引物(表1).經聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)產物用2.5%～3.0% (體積分數)的瓊脂糖凝膠電泳檢測,經溴化乙錠染色后在紫外線凝膠成像儀上成像,而對于多態性不明顯的引物的 PCR 產物,用8% (體積分數)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,銀染之后觀察拍照記錄.

表1 用于基因定位的引物序列

1.2.7 葉綠體相關基因的實時熒光定量PCR (qRT-PCR)分析

分別取野生型“嘉花1號”和突變體asl6植株的三葉期葉片,提取其RNA,并反轉為cDNA(RNA提取及反轉錄試劑盒分別購自全式金的TransZol Plant和TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix).利用qRT-PCR對葉綠體發育和葉綠素合成相關基因(引物序列如表2所示)進行RNA水平的表達量的分析(SYBR Green Realtime PCR Mix試劑盒購自東洋紡公司),實驗操作按照說明書進行,用到的儀器為ABI7500.

表2 用于qRT-PCR分析的引物序列

2 結果與分析

2.1 突變體的表型

圖1 野生型“嘉花1號”和突變體asl6植株生長各時期表型變化

在 25 ℃和32 ℃人工氣候箱條件下對突變體asl6和野生型“嘉花1號”植株苗期葉色表型進行觀察,突變體asl6發芽后長出的葉鞘、不完全葉以及第2、3片真葉都為白色,到四葉期突變體逐漸死亡(圖1),這表明該突變體葉色變化不受溫度影響,屬于水稻苗期白化致死突變.

2.2 突變體的光合色素含量變化

測定了野生型“嘉花1號”與突變體asl6的葉綠素及類胡蘿卜素含量,與野生型相比,該突變體葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的含量幾乎為零(圖2).由此可知,光合色素合成和積累受影響會導致植株苗期呈白化表型.

圖2 野生型“嘉花1號”和突變體asl6植株三葉期葉片光合色素含量

2.3 突變體葉綠體顯微結構

圖3 (a),(b) 野生型“嘉花1號”和(c),(d) asl6植株葉綠體顯微結構圖(箭頭標記為葉綠體)

通過觀察野生型“嘉花1號”與突變體asl6的葉綠體超微結構發現:野生型葉綠體內部存在完整清晰的類囊體片層結構,如圖3(a),3(b)所示;而突變體中觀察不到一個完整的葉綠體并且含有較多空泡,如圖3(c),3(d)所示.這說明該突變體的葉綠體發育受到影響,導致沒有正常的葉綠體,從而產生白化表型.

2.4 遺傳分析

2.5 基因定位

選取22株F2代白化苗進行連鎖分析,發現水稻第2染色體上的分子標記RM525(圖4)有強烈的偏態擴增,因此,判斷asl6位于第2號染色體上.然后擴大群體至2560株,如圖5(A)所示,將該基因定位在分子標記ID30471與ID32344之間,其遺傳距離分別為2.3 cM 和3.2 cM.為了進一步定位目標基因區域,定位群體擴大至4982株,將突變基因定位在ID31982與MM5712之間,物理距離約為293 kb,如圖5(B)所示.該區間跨越水稻日本晴基因組AP004159.3與AP004187.3之間的多個BAC克隆群(http://rice.plantbiology.msu.edu).

圖4 分子標記RM525在親本P1、P2及22株具有突變表型F2代單株的DNA分離帶型.P1:嘉花1號;P2:培矮64S

2.6 葉綠體相關基因的qRT-PCR分析

通過實時定量PCR來探究突變體asl6中與葉綠素合成、光合作用以及葉綠體發育相關基因的表達量.結果顯示:突變體中編碼原葉綠素酸脂氧化還原酶基因PORA等葉綠素合成的相關基因的表達量下調,如圖6(a)所示;psaA、psaB、psbA分別為光系統Ⅰ反應中心蛋白A、光系統Ⅰ反應中心蛋白B、光系統Ⅱ反應中心蛋白A,這些與光合作用相關的基因的表達量明顯下調,如圖6(b)所示.優先被nucleus-encoded RNA polymerase (NEP)轉錄的plastid-encoded RNA polymerase (PEP)核心亞基a、β、β′基因rpoA、rpoB、rpoC1等與葉綠體發育相關的基因的表達量也呈下調趨勢;而編碼核苷酸還原酶的大、小亞基RNRL、RNRS的表達量下調很小(圖7).這一結果與突變體苗期白化致死現象相吻合,表明asl6基因的突變影響了突變體中的與葉綠素合成、葉綠體發育以及光合作用相關的基因的表達,從而導致植株死亡.

圖6 突變體中與葉綠素合成(a)和 光合作用(b)相關的基因的表達分析

圖7 突變體中與葉綠體發育相關的基因的表達分析

3 討 論

葉綠體為半自主性細胞器,有120個基因[20],而這些基因只負責葉綠體內大約5%的蛋白,因此葉綠體的正常運作還需要細胞核基因的參與.當細胞核內基因發生突變時,均有可能影響葉綠體的正常發育.目前,水稻中已經有超過70種葉綠素/葉綠體缺陷突變體[21].本研究中通過測定葉綠素含量發現:突變體asl6的葉綠素含量幾乎為零;透射電鏡觀察不到一個完整的葉綠體且含有較多空泡;經qRT-PCR分析可知突變體中與葉綠素合成、葉綠體發育、光合作用相關的基因的表達量明顯下調.該結果與突變體幼苗期呈白化致死的現象相符合.而葉綠體發育早期相關質體分裂基因(FtsZ)和編碼核苷酸還原酶大小亞基(RNRL、RNRS)的表達量變化不大(圖7),說明ASL6基因可能參與調控葉綠體后期發育相關的基因.

本實驗在基因定位過程中,采用4982個單株F2分離群體,將該基因定位于第2號染色體的InDel分子標記ID31982與SSR分子標記MM5712之間約293 kb的區域內.通過生物信息學預測發現,該區間有33個有功能編碼蛋白的候選基因,11個未知功能表達的蛋白基因.通過水稻網站預測(http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/request.ep) 發現了在葉綠體中高表達,且與葉綠體發育相關的基因LOC_Os02g52470、LOC_Os02g52650、LOC_Os02g52744,對其測序發現其與野生型基因組序列沒有差異,這說明上述3個候選基因可能與突變體asl6白化致死無關.目前,在已鎖定的293 kb目標區間內,還沒有相關水稻葉色突變基因被報道.因此,asl6突變基因可能是一個新的葉色白化致死突變基因.今后,將在此基礎上擴大定位群體,發展更多新的分子標記,對該基因進行克隆和功能分析,這也將有助于更進一步了解水稻葉綠體發育分子的作用機理.