“基因—體質—疾病”關聯模式下4種中醫體質差異表達基因富集分析

孫占東 劉嘉 曾慶琪

摘要：目的 從系統生物學角度挖掘基因與4種中醫體質（濕熱質、血瘀質、特稟質、痰濕質）的相關性，探究體質形成及體病相關的微觀機理，為體質分類及體病相關理論提供生物學依據。方法 計算機檢索中國知識資源總庫（CNKI）、中國學術期刊數據庫（萬方數據）建庫至2016年12月31日收錄的中醫體質與基因表達相關文獻。收集4種中醫體質的差異表達基因，分別采用DAVID數據庫進行富集分析，包括基因組織富集分析、疾病分析、GO分析及通路分析。對DAVID數據庫分析結果進行下載整理。結果 4種中醫體質在基因層次上存在較大差異，每種體質顯著富集的基因功能、活性、通路、相關疾病、表達位置等均有特異性?；虮磉_模式不同，導致體質對疾病易感性及傾向性的差異。結論 本研究提示中醫體質形成的實質是基因表達模式的差異，病理變化由其改變所致。

關鍵詞：中醫體質；體病相關；基因；富集分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.022

中圖分類號：R2-05；R229 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）09-0091-05

Abstract： Objective To dig the correlation between genes and four TCM constitutions （phlegm-dampness， blood stasis， allergy， and dampness-heat）； To analyze microscopic mechanism of constitution formed and constitution-disease correlation； To provide biological basis for TCM constitution classification and constitution-disease correlation theory. Methods Literature about TCM constitutions and gene expressions in CNKI and Wanfang Database were retrieved by computers from the establishment of database to 31， December 2016. Differentially expressed genes of four TCM constitutions were collected， and DAVID database was used for enrichment analysis， including gene tissue enrichment analysis， disease analysis， GO analysis， and pathway analysis. The results of DAVID database analysis were downloaded and analyzed. Results Four TCM constitutions had differences in gene level， and each constitution had the specificity in significantly enriched gene function， activity， pathways， related diseases， and expression locations. Different patterns of gene expression led to the constitution differences in disease susceptibility and tendency. Conclusion The essence of TCM constitution formation is the change of gene expression patterns， and the pathological changes are also caused by the change.

Keywords： TCM constitutions； constitution-disease correlation； gene； enrichment analysis

隨著人類疾病譜的變化，其復雜性、多樣性促使個體化醫療模式成為新浪潮。中醫體質學說是以研究人類各個體質特征，以個體為對象，指導疾病的預防、治療以及養生康復的中醫基礎理論，與個體化醫療模式密切相關。王琦[1]提出的體質九分法被普遍認可。體質形成的微觀機制是中醫體質學研究必須面臨的科學問題[2]。體質的形成具備個體性的物質基礎，每種體質都有其特定的基因表達模式，體質宏觀的差異應源于微觀基因表達的差異[3]。因此，從分子水平探究體質形成的生物學機理十分必要。

目前中醫體質的基因組學研究表明，各種偏頗質在基因表達上普遍存在失調[4]?；蛑苯踊蜷g接決定了中醫體質對某些病癥種類的易罹性及傾向性，從而導致個體在病性、病位、病程、病變等方面的差異[5]。通過研究體質的基因表達基礎，即體質與基因、基因與疾病的相關性，預測體質與疾病的相關性，可為中醫體質學“體病相關”理論提供生物學依據。

基因功能富集分析又稱為功能聚類分析，其原理為超幾何分布，最終獲得一組基因集在某個功能分類中的顯著性條目，這些條目是與實驗目的有顯著關聯的、靶向性的基因功能類別，即導致樣本差異最重要的功能信息[6]。本研究整合4種體質（濕熱質、血瘀質、特稟質、痰濕質）的基因表達數據，采用系統生物學方法，對各體質的差異表達基因進行富集分析。以期從分子水平闡述中醫體質易感疾病的原因、性質、部位及其內在聯系，為調體防病提供參考。

1 資料與方法

1.1 數據來源及篩選

計算機檢索中國知識資源總庫（CNKI）、中國學術期刊數據庫（萬方數據），以主題詞“體質”“基因表達譜”進行模糊檢索，檢索范圍均從建庫至2016年12月31日。對結果逐一仔細閱讀，同時滿足下列標準予納入：①實驗樣本符合9種體質分類及判定標準[1]。②以偏頗體質為實驗樣本，平和體質為對照樣本，樣本量不小于3。③取樣于人體外周血液且應用芯片技術檢測基因表達譜。④文獻結果中明確報道偏頗質相對于平和質樣本的差異表達基因。

1.2 數據提取

對文獻中4種偏頗體質差異表達的基因進行提取收集，以基因列表（gene list）形式分別保存于獨立的文本文件中，基因列表格式：gene1，gene2，gene3...。如某種體質差異表達基因結果在文獻中以芯片ID形式報道，需對芯片ID進行轉換，找出該芯片參考資料，將芯片ID轉化為對應的正式基因符（official gene symbol），如ID（211300_s_at）→gene symbol（TP53）。最后對所獲得的每種體質差異表達基因去冗處理。

1.3 數據分析

采用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對收集的4種體質差異表達基因進行富集分析。DAVID為生物信息整合數據庫，知識庫豐富且易操作，可對輸入的基因集進行“一鍵式”系統綜合的生物功能注釋分析，目前被引用超過26 000次。將提取的基因列表文件輸入數據庫，在輸出結果中可直接獲得體質差異表達基因的組織、疾病、GO（gene ontology）、生物通路等富集信息，其輸出結果可另存為文本格式。對下載結果進一步篩選，當P<0.05時，富集結果有統計學意義，被作為該種體質顯著性的富集條目[7]。利用數據庫集成的分析功能，可明確基因功能、特性、表達位置等信息。

組織富集分析。對于給定的體質差異表達基因集，組織富集分析可快速識別其在人體組織中顯著表達的位置，用于分析細胞、組織、器官與體質癥候表現的關系。

疾病富集分析。基于OMIM數據庫收錄的人類遺傳疾病基因，將體質差異表達基因集作為輸入數據，通過疾病富集分析可獲得對應的疾病信息，為進一步體病相關研究提供依據。

GO富集分析。GO富集分析分為“molecular function”（分子功能）、“biological process”（生物過程）、“cellular component”（細胞組成）3部分，通過該項分析可找出在統計上顯著富集的GO條目，尋找影響體質形成的基因功能。

生物通路富集分析。利用KEGG數據庫，獲取體質差異表達基因參與的生物通路，分析生物通路的功能與體質形成的相關性，探究體質形成的微觀機制。

2 結果

2.1 中醫體質差異表達基因數據

經檢索，獲得文獻CNKI 107篇、萬方數據195篇。閱讀篩選后，進行4種體質差異基因數據提取、整理，獲得4種中醫體質差異表達基因集、文獻及實驗數據見表1。

2.2 4種中醫體質差異表達基因組織富集分析

組織富集可對基因表達位置進行定位研究，分析細胞、組織、器官與體質癥候表現的關系。4種中醫體質差異表達基因在人體分布位置存在較大差異。特稟質差異表達基因富集范圍較廣，多分布于脾臟、外周血淋巴細胞、自然殺傷細胞、血小板等免疫及血液系統，及肝臟、卵巢、胰腺等臟器。濕熱質差異表達基因分布于口腔、肝臟、骨髓、肺等部位，在白細胞、嗜中性粒細胞中也存在。痰濕質差異表達基因的分布多與生殖器官相關，如子宮、卵巢、胎盤，在上皮細胞與淋巴細胞中也有分布。血瘀質差異表達基因分布于骨髓、子宮、T細胞等。差異表達基因信息見圖1。

2.3 4種中醫體質差異表達基因疾病富集分析

特稟體質顯著富集得到13種疾病，其中8種為免疫系統疾病，2種與白血病相關；濕熱體質富集得到13種疾病（免疫系統疾病4種、腫瘤4種、口腔疾病2種及自然流產）；痰濕質富集得到4種疾?。[瘤2種、無精子癥及自身免疫性疾?。谎鲑|富集得到2種疾病（糖尿病1、2型）。1型糖尿病被特稟質、血瘀質共同富集，HIV感染被特稟質、濕熱質共同富集。4種體質差異表達基因疾病富集分析結果見圖2。

2.4 4種中醫體質差異表達基因GO富集分析

差異表達基因GO富集分析在三個層次上得到顯著富集的注釋條目結果為：濕熱質分子功能3條、生物過程21條、細胞組成12條；血瘀質分子功能7條、生物過程6條、細胞組成5條；特稟質分子功能7條、生物過程23條、細胞組成10條；痰濕質分子功能5條、生物過程10條、細胞組成11條。每種體質富集結果詳細注釋條目見圖3。

不同體質差異表達基因在生物體內功能、活性及表達位置不同，可能導致體質差異。差異表達基因主要參與的生物過程方面，濕熱質為防御真菌、細菌、病毒反應、免疫反應等，血瘀質為細胞增殖、內吞作用等，特稟質為免疫反應、信號轉導、MAPK活性激活、炎癥反應等，痰濕質為正向調節I-kappab激酶/NF-kappaB信號、自噬、IL-1細胞反應、IL-4負調控等。部分條目被多種體質共同富集，如蛋白質結合被特稟質、痰濕質、血瘀質共同富集，蛋白激酶結合被特稟質及血瘀質共同富集，poly（A） RNA結合被痰濕質、血瘀質共同富集，表明多種體質差異表達基因均參與重要的生物反應過程，各體質在組學層面存在內部聯系，提示兼具多種體質或體質間轉化的可能。

2.5 4種中醫體質差異表達基因生物通路富集分析

分析差異表達基因參與的生物通路，特稟質富集得到7條生物通路，其中4條（系統性紅斑狼瘡、抗原處理和表達、T細胞受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路）屬免疫系統，提示特稟質免疫系統較平和質增強。濕熱質富集得到4條通路，其中2條屬免疫疾病通路、2條與細胞吞噬相關，也展示出免疫活性上調。痰濕質富集得到4條通路，其中2條屬傳染性疾病通路，提示出炎癥反應的亢進，1條與鞘脂代謝相關，提示與脂類代謝疾病相關，1條為破骨細胞分化通路。血瘀質富集得到3條通路，1條通路與腫瘤的膽堿代謝相關，1條通路屬磷脂酰肌醇信號通路，與鈣離子轉運相關，1條與信號轉導與細胞能動性有關。各體質差異表達基因富集得到的條目不同，但在免疫反應、炎癥反應、代謝等方面均表現出較平和質增強的趨勢，所得結果可能為富集生物通路與體質特征的相關性及體質形成的微觀機制，通路信息見圖4。

3 討論

中醫體質學研究各體質類型的生理、病理特點，分析疾病的反應狀態、病變性質和發展趨向，從而指導預防和治療。然而，中醫體質形成的微觀機制尚不明確。本研究挖掘4種體質具有的特異性遺傳物質基礎，揭示不同體質間的微觀基因表達差異。

特稟質多與先天稟賦有關，也與后天失養相關，此類人群對外界環境適應能力較差。本研究結果表明，特稟質差異表達基因分布于免疫及血液系統，與免疫系統疾病高度相關，多參與免疫反應、信號轉導、MAPK活性激活、炎癥反應等，與系統性紅斑狼瘡、抗原處理和表達、T細胞受體信號通路、腫瘤壞死因子信號等免疫系統通路相關。提示特稟質與免疫系統和先天遺傳疾病關系密切，符合中醫理論。

濕熱質因先天不足，久居濕地；或喜食肥甘，長期飲酒，濕熱內蘊。此類人群周身乏力、面部痤瘡、口干口苦、便秘、尿短赤等。本研究結果表明，濕熱質差異表達基因分布于口腔、肝、肺等易“上火”部位，與腫瘤、免疫系統疾病及口腔病，防御真菌、細菌、病毒反應，免疫反應等密切相關。熱邪病位多變，其性上炎；濕邪重濁黏滯，其性趨下，故濕熱質易罹患疾病復雜多樣，但主要涉及感染性疾病。

“肥人多痰濕”，痰濕質常表現為嗜睡，喜食辛辣、肥甘厚膩，周身乏力、倦怠、身體沉重、大便黏膩等。本研究結果表明，痰濕質差異表達基因分布多與生殖器官，腫瘤、無精子癥等，正向調節I-kappab激酶/NF-kappaB信號、自噬、IL-1細胞反應、IL-4負調控等，脂類代謝疾病通路及炎癥通路有關。提示痰濕質多與肥胖相關，符合中醫理論。

血瘀質常因情志、飲食、勞逸等內傷致血行不暢，或因外邪、內傷、氣虛、邪熱迫血妄行，表現為面色青黯、疼痛、拒按、舌質紫黯等。本研究結果表明，血瘀質和腫瘤發病相關，與血瘀質常致癥瘕積塊的中醫理論相符；血瘀質出現磷脂酰肌醇信號通路變化，涉及鈣離子轉運，提示與心腦血管疾病相關。疾病富集提示血瘀質與糖尿病存在高度的體病相關性。

綜上，不同體質的基因表達模式存在差異，易患疾病與體質存在高度相關性。各體質在基因層次有一定聯系，提示兼夾體質存在基因組學基礎。但本研究僅收集了差異表達基因，未對體質間相關性深入分析，后續可結合個體體質特征及基因表達模式進一步研究。中醫體質以整體觀為基礎，系統生物學也以整體觀研究生命本質。采用系統生物學方法，可對多種體質在蛋白質組學、代謝組學方面開展研究，體內的生命物質如酶、細胞因子、代謝產物等，對體質形成同樣發揮著重要作用，可進一步印證體質差異的客觀基礎。

參考文獻：

[1] 王琦.中醫體質學[M].北京：人民衛生出版社，2008.

[2] 王琦.論中醫體質研究的3個關鍵問題[J].中醫雜志，2006，47（4）：250-252.

[3] 孫艷.論基因與體質的相關性[J].長春中醫藥大學學報，2009，25（1）：3-4.

[4] 王濟，李英帥，李玲孺，等.9種中醫體質類型的基因組學研究[J].中華中醫藥雜志，2014，29（12）：3871-3873.

[5] 童福易，賴仁勝，薛博瑜.試論中醫體質與疾病的發生[J].現代中西醫結合雜志，2012，21（10）：1128-1130.

[6] 劉明，王米渠，丁維俊，等.表達譜芯片數據的基因功能富集分析[J]. 生物醫學工程學雜志，2010，27（5）：1166-1168，1196.

[7] HUANG D W， SHERMAN B T， LEMPICKI R A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources[J]. Nature Protoc，2009，4（1）：44-57.

[8] 周珊珊.濕熱體質人群差異表達基因的篩選及其功能初探[D].廣州：廣州中醫藥大學，2016.

[9] 田栓磊.血瘀體質理論及其外周血基因表達譜的研究[D].北京：北京中醫藥大學，2009.

[10] 王睿林.過敏體質理論及其外周血基因表達譜研究[D].北京：北京中醫藥大學，2009.

[11] 高京宏.痰濕體質機制及基因表達譜研究[D].北京：北京中醫藥大學，2005.

（收稿日期：2017-06-26）

（修回日期：2017-07-27；編輯：向宇雁）