腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)miRNA—122對(duì)肝癌患者的作用

徐煒 王文娟 歐陽(yáng)良良

[摘要]目的 分析腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）表達(dá)miRNA-122對(duì)肝癌患者的作用。方法 選取2015年1月～2018年1月于我院進(jìn)行診斷的20例肝癌患者作為HCC-1組，另選取20例健康者作為C-1組，分別提取兩組患者的外周血單核細(xì)胞，采用q-PCR法檢測(cè)兩組患者的血清miRNA-122水平。選取40只健康SD裸鼠，將其隨機(jī)分為HCC組（n=20）與Scamble組（n=20）。其中，HCC組采用皮下注射0.5 ml肝癌Hep-2細(xì)胞懸液，而Scamble組則皮下注射0.5 ml生理鹽水。造模后，連續(xù)5 d采用腹股動(dòng)脈取血法收集兩組裸鼠模型動(dòng)脈血，分離獲取外周單核細(xì)胞，以q-PCR定量分析技術(shù)檢測(cè)TMA中miRNA-122水平。結(jié)果 HCC-1組患者的miRNA-122水平顯著低于C-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。造模2 d后，HCC組裸鼠模型TAM中的miRNA-122水平顯著低于Scamble組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 肝癌患者及肝癌裸鼠模型TAM中miRNA-122水平偏低，miRNA-122具有調(diào)控肝腫瘤生長(zhǎng)的作用。

[關(guān)鍵詞]肝癌；巨噬細(xì)胞；miRNA-122

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）7（c）-0127-03

[Abstract]Objective To analyze the effect of miRNA-122 expression in tumor associated macrophages （TAM） on hepatocellular carcinoma patients. Methods A total of 20 cases of patients with hepatocellular carcinoma dianosed in our hospital from January 2015 to January 2018 were selected as the HCC-1 group， and another 20 healthy people were selected as the C-1 group. The peripheral blood monocytes in the two groups were collected and the level of serum miRNA-122 was tested by q-PCR technology. Forty healthy SD nude mice were selected and randomly divided into the HCC group （n=20） and Scamble group （n=20）. The HCC group was injected subcutaneously with 0.5 ml Hep-2 cell suspension of liver cancer， while the Scamble group was given 0.5 ml normal saline. After modeling， arterial blood was collected from two groups of nude mice by abdominal femoral artery blood sampling for 5 consecutive days， and peripheral mononuclear cells were isolated and obtained. The level of miRNA-122 in TMA was tested by q-PCR quantitative analysis technique. Results The level of miRNA-122 in the HCC-1group was significantly lower than that in the C-1group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Two days after modeling， the level of miRNA-122 in TAM of nude mice in the HCC group was significantly lower than that in the Scamble group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The level of miRNA-122 in TAM of liver cancer patients and liver cancer nude mice is lower. The miRNA-122 plays a role in regulating the growth of liver tumors.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； Macrophages； MiRNA-122

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)位列第5，在我國(guó)位列第3，且呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。有研究表明，在HCC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophage，TAM）與HCC相互影響、相互作用，促進(jìn)肝癌發(fā)生和發(fā)展[3-4]。miRNA在免疫調(diào)控中起到重要作用，其中包括miRNA-122。本研究擬探討TAM中的miRNA-122表達(dá)對(duì)肝癌的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1月～2018年1月在我院進(jìn)行診斷的20例肝癌患者作為HCC-1組，男11例，女9例；年齡38～64歲，平均（45.3±6.4）歲；患者均為原發(fā)性肝癌。另選取20例健康人作為C-1組，男15例，女5例；年齡35～61歲，平均（41.8±7.1）歲。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均知曉本研究情況并簽署知情同意書。

選取40只健康SD裸鼠，雄性，平均體重（200±25）g，由九江學(xué)院動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)：SCXK（贛）2007-0005]，將其隨機(jī)分為HCC組與Scamble組，每組各20只。實(shí)時(shí)定量檢測(cè)試劑盒、內(nèi)切酶、熒光定量PCR檢測(cè)引物、質(zhì)粒提取試劑盒、人外周血淋巴細(xì)胞分離液于南昌長(zhǎng)城生物公司購(gòu)買。

1.2方法

1.2.1采集外周血TAM 分別采集兩組患者的清晨空腹靜脈血約10 ml，經(jīng)3000 r/min離心10 min，保留分層液及以上部分于-24℃保存。采用q-PCR法檢測(cè)兩組患者外周血miRNA-122水平。

1.2.2構(gòu)建肝癌裸鼠模型 HCC組20只裸鼠皮下注射0.5 ml肝癌Hep-2細(xì)胞懸液，密度約為1×105個(gè)/ml，建立肝癌裸鼠模型。Scamble組20只裸鼠于皮下注射0.5 ml生理鹽水。造模后，每天分別在HCC組與Scamble組中隨機(jī)選取4只裸鼠模型，采用腹股動(dòng)脈取血法收集兩組裸鼠模型血約5 ml，以3000 r/min離心10 min，保留分層液及以上部分于-24℃保存。采集造模后5 d兩組裸鼠模型的外周血單核細(xì)胞。

1.2.3 q-PCR法檢測(cè)miRNA-122水平 分別將HCC-1組、C-1組、HCC組與Scamble組得到的外周血單核細(xì)胞和TAM種植在6孔板中，經(jīng)短暫孵育后提取總RNA，以miRNA-122特異性莖環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以人U6做為內(nèi)參，采用CT法對(duì)miRAN-122進(jìn)行q-PCR定量分析[5-6]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 HCC-1組與C-1組患者TAM中miRNA-122水平的比較

HCC-1組患者的miRAN-122水平[（0.52±0.21）ng/ml]顯著低于C-1組[（0.84±0.43）ng/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 HCC組與Scamble組裸鼠TAM中miRNA-122水平的比較

造模2 d后，HCC組裸鼠TAM中的miRNA-122水平顯著低于Scamble組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。

3討論

受腫瘤源性生長(zhǎng)因子尤其是巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）的影響，單核細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中分化為巨噬細(xì)胞，主要包括Ⅰ型巨噬細(xì)胞（M1）和Ⅱ型巨噬細(xì)胞（M2），二者均具有顯著的可塑性、多功能性、極化性等特點(diǎn)[7-8]。但M1和M2巨噬細(xì)胞生理功能是絕然不同的。M1是一種典型的活化巨噬細(xì)胞，具有分泌促炎性因子、趨化因子、抗原提呈等作用，從而激發(fā)免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫監(jiān)視功能。而M2巨噬細(xì)胞為替代性活化巨噬細(xì)胞，其功能與M1巨噬細(xì)胞相反，其抗原提呈能力較弱，且促進(jìn)IL-10與TGF-β表達(dá)，抑制免疫應(yīng)答。此外，M2巨噬細(xì)胞還具有清除異物、促進(jìn)傷口愈合、血管再生等作用[9-10]。因此，M2巨噬細(xì)胞可通過(guò)抑制抗原提呈細(xì)胞活性、促進(jìn)T細(xì)胞增殖等方式降低腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答[11]。

TAM與腫瘤之間存在密切聯(lián)系。一方面，腫瘤環(huán)境可影響單核巨噬細(xì)胞分化；另一方面，分化后的TAM又可抑制腫瘤免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育。在腫瘤微環(huán)境中，單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤組織后，腫瘤組織分泌的IL-6與IL-10因子可通過(guò)招募巨噬細(xì)胞聚集，產(chǎn)生PEG2，從而誘導(dǎo)并促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化為近似M2表型的TAM。而分化成熟的TAM直接分泌EGF、IL-6、CXCL-8等因子維持腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成和抑制獲得性免疫[12-13]。此外，TAM具有增殖、遷移、轉(zhuǎn)移等腫瘤新生物的關(guān)鍵特征[14]，其水平與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的下降率成負(fù)相關(guān)，且較多的臨床研究表明，TAM增高與腫瘤患者預(yù)后不良成正相關(guān)[15-17]。

在腫瘤基質(zhì)中存在許多巨噬細(xì)胞的分泌物，可直接刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移。這些因子包括上皮生長(zhǎng)因子（EGF）、FGF家族因子、TGF-β、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、趨化因子和細(xì)胞因子。IL-1β可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。在IL-1β基因的敲除鼠中黑色素瘤細(xì)胞或乳腺、前列腺腫瘤均不會(huì)轉(zhuǎn)移，表明了IL-1β在腫瘤微環(huán)境中的重要性。在與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在巨噬細(xì)胞中TNF-α依賴的MMP誘導(dǎo)，巨噬細(xì)胞可增加惡性細(xì)胞的侵襲性[18]。在肺癌，通過(guò)促進(jìn)基質(zhì)和血管生長(zhǎng)因子的生成，TAM可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

TAM產(chǎn)生和釋放一些免疫調(diào)控因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10和IL-12[19-20]。據(jù)報(bào)道，這些因子可以直接或間接抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，大量的實(shí)驗(yàn)與臨床研究表明，TAM與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)。TAM產(chǎn)生上皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞因子及趨化因子，促進(jìn)腫瘤的存活、增殖和入侵[20]。此外，局部炎癥或腫瘤細(xì)胞釋放的免疫抑制介質(zhì)削弱了宿主的抗腫瘤反應(yīng)，并且促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

目前研究認(rèn)為miRNAs與腫瘤形成密切相關(guān)，其中miRNA-122在肝臟中是特異表達(dá)，而且表達(dá)量較高。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-122在肝癌組織中表達(dá)水平越低，肝癌分化越差，暗示著不良預(yù)后。

綜上所述，肝癌患者及肝癌裸鼠模型TAM中的miRNA-122水平偏低，miRNA-122具有調(diào)控肝腫瘤生長(zhǎng)的作用，臨床研究需要進(jìn)一步深入。

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（收稿日期：2018-05-14 本文編輯：孟慶卿）