有氧運動激活BDNF/miR-195/Bcl-2信號通路抑制CUMS抑郁小鼠海馬神經細胞凋亡

屈紅林，謝 軍，陳嘉勤，劉瑞蓮，彭 琪，李 娣，陳 偉，陳伊琳，陳 銳，卲長鳳，袁阿芳

抑郁癥又稱為抑郁障礙性疾病，是以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的心境障礙類精神疾病[1]。臨床上已經證實抑郁癥不只是簡單的心理病變，同時還是一種功能性病變，且隨著病程的延展，易造成患者大腦海馬區病變，隨即功能性病變就會轉化為器質性病變[2]，造成海馬神經元變性[3-4]、萎縮[5]與丟失[6]等，并已被眾多學者所證實[7-8]。有研究指出，抑郁癥患者前額皮層與海馬區的BDNF的表達減少，功能受損，致使神經元萎縮，血液中BDNF的水平降低，而抗抑郁治療能夠增加BDNF的表達，阻斷由于抑郁壓力導致的生長因子表達的缺陷[9]。也有研究提出質疑，在動物試驗中，BDNF敲除后并未出現抑郁樣癥狀，同時，除海馬和前額皮層外的其他腦區，如伏隔核、腹側被蓋區等BDNF的高表達反而對抑郁起到了加重作用，由此，實驗人員[10]認為抑郁癥發病機制的BDNF假說僅局限于海馬區域及五羥色胺再攝取抑制劑（Selective Serotonin Reuptake Inhibitors，SSRIs）的作用效果。B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）作為細胞凋亡研究中最受重視的基因之一，以其抑制凋亡的作用倍受關注。Bcl-2的過度表達能增強所觀察細胞對大鼠細胞毒素的抵抗作用，這一作用引導人們認識凋亡的各信號轉導路徑有了一個共同的交匯點。從前期的研究來看，Bcl-2抑制細胞凋亡的可能作用機制與降低氧自由基的產生與脂質過氧化物的形成[11-12]、抑制鈣離子跨膜流動[13-15]、離子通道蛋白[16]及其吸附/錨定蛋白等[17]的作用機制關系密切。最新的研究表明，抑郁大鼠海馬神經元細胞凋亡因子顯著增加，并伴有顯著的抑郁樣行為[18-19]，有氧運動可通過提高慢性應激實驗鼠海馬神經的可塑性發揮抗抑郁作用[20]，但有氧運動是否能夠干預抑郁鼠海馬神經細胞凋亡及其作用機制鮮有報道。

有文獻[21]報道，miR-195可抑制細胞周期的轉換，誘導細胞凋亡的發生，在癌癥、腫瘤及心血管疾病、神經系統疾病的發生與發展過程中發揮作用。miR-195可以通過抑制膠質瘤細胞的增殖，調控Caspase-3和Caspase-9的活性促進膠質瘤細胞凋亡與壞死[22-25]，促進對膠質瘤的治療作用。N.MELLIOS等[26]的報道顯示精神分裂癥患者腦脊液中的miR-195可通過調節BDNF的表達，改變下游γ-氨基丁酸能神經元的轉錄過程，由此可見，BDNF與miR-195的調控作用可能在認知功能中發揮作用。瞿準等[27]的研究結果顯示，創傷性腦損傷患者血清與模型鼠腦組織中miR-195水平顯著高于對照組，抑制神經細胞生長增殖并促進其凋亡，而BDNF可通過抑制miR-195的表達促進神經細胞生長增殖，抑制其凋亡。R.SINGH等[28]研究發現，miR-195的種子位點與Bcl-2結合后，便抑制或降解Bcl-2的表達，增強活化Caspase的促凋亡過程[29]，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖[30]。潘瑩等[31]研究也證實了這一觀點，即miR-195可通過調控Bcl-2/Bax途徑抑制細胞增殖或促進細胞凋亡。神經元變性引起的海馬體積萎縮[32]與神經元突觸結構與功能退化[33-34]是重癥抑郁癥患者影像學與尸檢發現的又一重要病理特征。那么有氧運動是否會抑制抑郁模型動物海馬神經退變與凋亡，miR-195是否參與其中并不清楚。由此，課題組針對CUMS抑郁小鼠的海馬組織miRNA與mRNA進行了高通量測序并對miRNA與mRNA的測序結果進行相關性分析，分析結果發現，miR-195與海馬神經細胞的凋亡存在高度相關性，且這一結果還會明顯受到有氧運動干預的影響（論文待發表）。因此，本研究擬探討有氧運動對CUMS抑郁小鼠海馬miR-195及其BDNF/miR-195/Bcl-2信號通路表達和海馬功能的影響。

1 研究對象與方法

1.1 主要試劑和儀器

主要試劑：DAB顯色試劑盒（武漢博士德）、ELISA試劑盒（ABclonal，美國）、Trizo（lInventragtion）、反轉錄試劑盒（TAKARA，美國）、兔抗多克隆抗體BDNF、Bcl-2（CUSABIO）、PCR mRNA引物（由上海生工設計與合成）、miRNA引物（由廣州銳博生物科技有限公司設計與合成）、蛋白裂解液、TUNEL試劑盒（Sigma-A ldrich）。

主要儀器：YD-6D型生物組織石蠟包埋機、YD-A生物組織攤烤片機、LEICA RM 2235切片機、Bio-Rad電泳儀與電泳槽、MB16-414酶標儀、Bio-Rad CFX96Touch實時熒光定量PCR儀、Nikon Eclipse Ti-SR正置熒光顯微鏡、Nikon DS-U3成像系統、T10Basic高速組織勻漿機。

1.2 動物分組與CUMS抑郁模型制備

動物分組：8周齡健康雄性KM種屬小鼠36只（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK湘2016-0002），隨機數字法分為對照組（ControlGroup，CG）、CUMS抑郁模型組（Model Group，MG）和抑郁+有氧運動組（Depression and exercise Group，EG），每組12只。所有動物在室溫為（25±1）℃、濕度50%的標準動物房內飼養，標準齒啃類動物干燥飼料喂養，自由飲食，光照時間各為12 h。CG組常規籠內安靜飼養，MG和EG組進行CUMS抑郁造模，EG組造模成功后進行為期8周的有氧運動跑臺訓練。

CUMS抑郁模型制備：造模實驗動物適應性喂養1周后，借鑒馬柯[35]、信欣等[36]CUMS抑郁造模方法改良進行13種慢性不可預知性應激因子（晝夜調整、光照性質、禁食、禁水、傾斜45℃鼠籠、潮濕墊料、4℃冰水游泳、45℃高溫游泳、水平震蕩、輕夾鼠尾、束縛、白噪音、間斷閃光）刺激，應激因子按照隨機數字法生成刺激方案，并依據相鄰兩天實施不同刺激做出微調，以防實驗動物產生適應，每天按照1～2種刺激安排，總造模時間為28天。

1.3 有氧運動方案

有氧運動方案參考Bedford訓練模型[37]略加改動，EG組小鼠在造模成功后進行適應性跑臺運動1周，適應性訓練按照開始強度為10m/min，0°坡度，每天遞增10min，共計6天。正式訓練以10m/min，0°坡度，60min/d，6天/周，連續訓練8周。運動訓練時間均安排在上午9：00-10：30進行。上述訓練方案無小鼠死亡。

1.4 神經行為學評定

強迫游泳（Forced Sw imming Test，FST）：采用直徑為10 cm，容量為2 L的圓形燒杯，水深10 cm，水溫控制在（25±1）℃，ANC酷睿HD1080P高清攝像頭記錄小鼠6min內不動狀態潛伏期與第3～6min內的不動總時間。

強迫懸尾（Tail Suspension Test，TST）：采用自制周壁與底部均為黑色、箱體頂部有25W白熾燈照明的懸尾箱，V11.60.00正版監控軟件錄像，記錄實驗鼠6min內不動狀態潛伏期與第3～6min內的不動總時間。

上述神經行為學評定過程中，為減少人為誤差，每只小鼠采取3人同時觀察與記錄，取平均值。

1.5 樣本處理及生化指標檢測

腦在體固定及腦組織取樣：8周有氧跑臺運動結束，當天進行神經行為學評定。所有小鼠禁食過夜，次日按照50mg/kg體重的劑量腹腔注射1%的戊巴比妥鈉麻醉后，每組隨機選取2只小鼠，迅速開胸，用頭皮針自心尖處刺入主動脈，動脈夾固定，快速用眼科剪于右心耳處剪開，4℃的冰生理鹽水快速灌注，后改用4%的多聚甲醛溶液灌注，直至小鼠身體及尾巴完全僵硬、肝臟腫大且為白色為止。灌注結束后，冰上迅速剪開頭皮，暴露顱骨，從枕骨大孔沿顱骨的矢狀縫剝離顱骨和腦膜，剪刀靠近顱骨底部小心取出腦組織，置于4%的多聚甲醛溶液固定48 h以上。

血液取樣與生化檢測：麻醉同上，開胸后，2m L真空抗凝管自心臟抽取新鮮血液，冷凍離心提取上清液。嚴格按照試劑盒說明書對血清BDNF含量進行檢測。

海馬組織取樣：處死后的小鼠冰上剝離頭部皮膚，暴露顱骨，眼科鑷自枕骨大孔輕輕撬開顱骨，充分暴露腦組織，小心剝離大腦左右皮層，暴露整個海馬組織，玻璃分針剝離海馬組織與大腦皮層及周圍的腦組織，取出海馬，冰PBS沖洗，濾紙吸掉多余水分，Trizol浸泡，-80℃冰箱凍存備用。

1.6 TUNEL法檢測海馬神經細胞凋亡率

4%的多聚甲醛對小鼠進行心臟在體灌注后取腦，4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，進行梯度乙醇脫水、石蠟包埋，冠狀切片，依次進行二甲苯梯度脫蠟、梯度乙醇復水、Proteinase K工作液37℃反應30min、PBS漂洗3×5min，室溫固定30min，PBS漂洗3×5min，浸入封閉液，室溫封閉10min，PBS漂洗3×5min，進行標記反應，即加入TUNEL反應液，置于濕盒中避光反應，37℃×1 h（除陰性對照組補加TdT酶外，其余組加入50μLTdT+450μL dUTP液），去離子水稀釋20×SSC（比例1：10）室溫15 min終止反應，PBS漂洗3×5min，浸入0.3%H2O2/PBS中封閉內源性過氧化物酶活性，室溫孵育5min，PBS漂洗3×5min，滴加50μLStreptavidin-HRP工作液，濕盒避光37℃反應30min，50～100μLDAB顯色劑與底物反應顯色，去離子水漂洗數次，蘇木素對細胞核選擇性復染，中性樹膠封片，光學顯微鏡下進行TUNEL陽性細胞計數，計數時針對每張片的小鼠海馬CA區隨機選取10個高倍視野（40×10倍），計算細胞凋亡率。TUNEL陽性細胞形態多樣化呈灰褐色，即凋亡細胞，正常細胞形態多為圓形并呈成藍紫色。

1.7 免疫組織化學染色

石蠟包埋與切片同上。切片脫蠟至復水，蒸餾水漂洗，微波抗原修復，PBS清洗，于濕盒中，免疫組化筆標記，干燥后再濕潤，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，一抗孵育（BDNF，1：50），4℃過夜，PBS清洗，二抗孵育（37 ℃，20min），PBS清洗，滴加新鮮配制的DAB顯色液，室溫放置3～5min，流水沖洗，終止顯色反應（必要時需要復染或進行濃硫酸降解），滴加蘇木素復染，室溫放置3min，流水沖洗，風干后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察海馬組織內神經核的陽性細胞及其定位，細胞核藍染，胞漿或細胞膜出現棕黃色顆粒沉著即為陽性細胞。每組均設置空白對照（PBS代替一抗、二抗）和陰性對照（PBS代替一抗）。

1.8 western blot

海馬組織約23mg，電動研磨器研磨粉碎，蛋白裂解液提取總蛋白質，酶標儀測定蛋白質濃度，并將各組勻漿總蛋白濃度用PBS調整一致，進行蛋白定量。等量蛋白質上樣、電泳、轉模后，3%的（W/V）脫脂牛奶的TBST封閉2 h，加入兔抗多克隆抗體BDNF（1：1 000），4 ℃過夜，室溫復溫30min后，加入顯色劑綴合的抗兔IgG二抗抗體（1：2 000）孵育1 h，TBST清洗，ECL發光。內參為β-actin（1：10 000）。觀察條帶并拍照。

1.9 總RNA提取

取小鼠海馬組織，使用Trizol試劑，按照說明書試驗流程提取總RNA，并用Q5000超微量分光光度計測定總RNA質量和濃度。

1.10 RT-PCR

常規Trizol試劑提取海馬總RNA，嚴格按照高容量逆轉錄試劑盒（TAKAEA Bio，日本）說明書操作步驟反轉錄合成cDNA，后進行RT-PCR反應，管家基因為GAPDH。BDNF、Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAPDH等的引物序列見表1。反應條件為95 ℃ 10min，1循環預變性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，40循環PCR反應；72 ℃ 10min，退火。每樣復孔3次，利用2-△△Ct法計算相對基因表達量。

表1 m RNA基因引物序列Table1 The Gene Primers

海馬組織總RNA提取同上。按照miRNA逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，再以此cDNA為模板按PCR試劑盒說明書進行PCR反應。引物由銳博生物科技有限公司設計與合成，U6為內參。反應條件為95℃30 s，1循環預變性；95℃5 s，65℃30 s，39個循環PCR反應，95℃30 s退火。每樣復孔3次，利用2-△△Ct法計算miR-195的相對基因表達量。

1.11 數據統計

所有數據均采用SPSS20.0統計軟件進行統計分析，采用單因素方差分析進行統計學處理。顯著性差異，選擇P＜0.01與P＜0.05水平。所有實驗數據以均數±標準差（X±SD）表示。

2 研究結果

2.1 CUMS抑郁小鼠造模效果評定

對CG組和MG組小鼠神經行為學評定（見圖1a）結果顯示，CG組小鼠神經行為功能正常，求生欲望強烈；MG組小鼠在抑郁后強迫游泳和強迫懸尾的不動時間顯著延長。ELISA檢測結果顯示，MG組較CG組小鼠血清BDNF水平下降（P＜0.01，見圖1b）。免疫組化檢測結果如圖3所示，CG組小鼠BDNF陽性細胞廣泛分布于海馬的CA1、CA4區的錐體細胞層與齒狀回的顆粒細胞層，形態規則著色較深且排列密集；MG組小鼠海馬BDNF陽性細胞數量顯著減少，散在分布且有些細胞呈空泡狀或萎縮狀，胞漿著色淺，胞體減小甚至消失。TUNEL細胞凋亡檢測結果顯示，MG組小鼠海馬CA區凋亡細胞數顯著增加（P＜0.01，見表2）。MG組小鼠海馬BDNF的RT-PCR檢測結果，也顯示顯著降低。依據以上相關檢測結果，可以認定CUMS抑郁模型造模成功。

圖1 8周有氧運動結束后各組小鼠FST、TST評定結果、血清BDNF含量變化柱狀圖Figure1 The Changed Result in Mice After 8Weeks

2.2 CUMS抑郁小鼠海馬BDNF/miR-195/Bcl-2信號通路相關基因的差異表達

MG組小鼠海馬BDNF表達下調，miR-195表達增加（P＜0.01，與CG組相比），Bcl-2表達雖有降低，但不呈顯著性差異（P＞0.05），而Bax和Caspase-3mRNA表達均顯著增加（P＜0.01）（見圖2），提示模型組小鼠海馬神經的miR-195表達增加，靶向抑制Bcl-2的表達，顯著激活促凋亡基因，內源性凋亡信號通路中凋亡蛋白表達顯著增加，海馬神經細胞凋亡作用顯著，功能降低。

圖2 各組小鼠海馬m RNA、miR RT-PCR檢測結果示意圖Figure2 The Changed Expression ofmiR-195，BDNF，Bcl-2，Bax and Caspase-3 in M ice Hippocam pus

2.3 有氧運動激活BDNF/miR-195/Bcl-2信號通路相關基因表達抑制海馬凋亡，促進功能修復

EG組小鼠強迫游泳和強迫懸尾的不動時間趨于正常，提示有氧運動能提高CUMS抑郁小鼠的求生欲望，有效地保護海馬免受抑郁損傷。EG組海馬組織BDNF表達顯著性增加，miR-195表達減少（P＜0.01，與MG相比），Bcl-2表達水平顯著升高（P＜0.01，見圖2），BDNF的這一結果在ELISA檢測結果得到驗證（見圖1）；Bax和Caspase-3mRNA表達水平顯著降低。揭示有氧運動可能對上述凋亡基因的激活有抑制作用。相關性分析結果還顯示，海馬BDNF與miR-195呈顯著性負相關。從BDNF免疫組化與TUNEL細胞凋亡的檢測結果來看，有氧運動雖不能有效修復因抑郁導致的海馬神經核萎縮與空泡樣變性，但EG組小鼠海馬組織的BDNF陽性細胞表達數量明顯增加，部分胞體輪廓清晰，胞漿著色明顯且形態完整（見圖3）。相同視野區域下的TUNEL細胞凋亡檢出率也得到有效控制（P＜0.01，見表2）。提示有氧運動可有效抑制CUMS抑郁小鼠海馬神經細胞凋亡的發展，這可能與有氧運動促進海馬齒狀回神經細胞增殖有關。

圖3 各組小鼠BDNF表達變化Figure3 The Changed Expression of BDNF in Mice

表2各組小鼠海馬BDNF陽性細胞與TUNEL細胞凋亡率檢測結果統計表Tab le2 The Resultof Apop totic Rate o f BDNA Positive Cells and TUNELCells in Hippocampus

2.4 BDNF與miR-195及其與細胞凋亡間的關系

miR-195隸屬miR-15家族，其序列是哺乳動物特有，并具有高度保守性[38]。目前已證實其成熟序列為：5’-UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC-3’，可通過與靶基因不完全互補抑制靶基因的翻譯[39]，有研究顯示其作用的靶基因主要包括WEE1、CDK6、Bcl-2、BDNF、Arl2、FLT3等[40]。從Targetscan 6.2預測軟件獲取miR-195與BDNF基因3’UTR區互補結合位點，據此構建miR-195種子區突變體堿基對。miR-195與BDNF間可能的作用關系，如圖4所示，BDNF的3’UTR端具有miR-195的結合位點，因此miR-195能特異性作用于BDNF的3’UTR，抑制BDNF的表達[41]，且除了miRNA轉錄后抑制BDNF表達外，BDNF自身也能調節miR-195的表達。Pearson線性相關分析結果顯示，miR-195表達水平與BDNF表達水平呈顯著性負相關（r=0.779，P＜0.01）。在研究中我們發現miR-195顯著抑制Bcl-2的蛋白表達水平。Pearson線性相關分析顯示，miR-195表達水平與Bcl-2表達水平呈顯著性負相關（r=0.606，P＜0.01）（見圖5-7）。

圖4 miR-195與BDNF的序列比對Figure4 Target Validation of miR-195

圖5 BDNF的western blot檢測結果Figure5 The BDNF Result of western blot

圖6 ME組miR-195與BDNF間的相關性分析Figure6 The Relation Between miR-195 and BDNF of MEGroup

圖7 ME組miR-195與Bcl-2間的相關性分析Figure7 The Relation Between miR-195 and Bcl-2 of MEGroup

3 分析與討論

實驗采用慢性不可預見性應激刺激進行抑郁造模，與人類抑郁癥患者中慢性、低水平的應激源誘發抑郁癥的作用機理較為接近，也是研究抑郁癥病理改變的良好模型，倍受國內外專家學者的廣泛認可與應用[42]。抑郁后海馬功能發生改變，進而影響前額葉皮質、杏仁核與伏隔核神經環路功能[43]，誘導下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）[44]、下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT軸）[45]等應激反應的失調，HPA軸功能的亢進又易引起血液與腦內糖皮質激素水平的升高，高濃度的糖皮質激素又反過來選擇性的損傷大腦海馬神經元[46]，造成惡性循環，進一步損傷抑郁癥患者海馬神經，導致包括神經元再生障礙、神經營養低下等的海馬神經元病理性改變[47]。本實驗室前期的研究也已經證實，有氧運動可有效改善缺血性腦損傷及海馬功能紊亂[48]。本研究發現實驗小鼠產生抑郁時，海馬神經功能下降，BDNF的表達下調，出現細胞空泡狀或萎縮狀，胞漿著色淺，胞體小或消失，細胞凋亡率增加明顯，呈現顯著的抑郁癥海馬癥狀特征。實驗結果還發現miR-195的表達顯著增強，同時，促凋亡基因Bax、Caspase-3的表達顯著升高（P＜0.01，與CG組相比），推測此凋亡過程可能與抑郁小鼠BDNF的下調誘導miR-195的表達升高，促使促凋亡因子Bax、Caspase-3等的高表達有關，而抑凋亡因子Bcl-2的表達未呈現顯著性改變。

有氧運動抑制海馬神經細胞凋亡的研究已經得到證實[49-51]，但針對有氧運動對抑郁后海馬保護效應的機制研究報道較少，僅限于神經可塑性及空間學習與記憶能力等的研究[52-54]。本研究結果顯示，MG小鼠血清BDNF蛋白含量和海馬BDNFmRNA表達較CG組明顯降低，有氧運動能顯著提高海馬功能，增強CUMS抑郁小鼠的求生欲望，顯著降低強迫游泳和強迫懸尾的不動持續時間，增加海馬BDNF的表達及血清BDNF的活性，改善了抑郁小鼠海馬功能。同時，本研究還發現，抑郁小鼠在8周的有氧運動干預后海馬神經細胞Bax、Caspase-3的促凋亡因子的表達量顯著降低，Bcl-2抗凋亡因子的表達量顯著增高。說明，有氧運動可促進BDNF和抗凋亡因子Bcl-2mRNA的表達，下調miR-195的表達，從而抑制促凋亡因子Bax、Caspase-3mRNA等的表達，具有顯著性意義。

本實驗海馬神經形態學測試的結果顯示，持續8周的有氧運動并不能修復抑郁小鼠已萎縮和空泡樣的海馬神經元，這可能與抑郁小鼠海馬結構損害的不可逆性關系密切。但測試的結果也反映出抑郁小鼠海馬功能得到了明顯改善，一方面，可能與有氧運動增加海馬神經細胞血供，促進新的突觸神經生成及聯系增多[55]、海馬體活躍度增強[56]，海馬齒狀回的神經細胞增殖[57-58]，調節海馬神經發生增加[59]，促使神經再生發芽[60]，BDNF的表達上調，進而抑制TUNEL陽性細胞的表達等有關[61]；另一方面，還可能與有氧運動促進前額葉、海馬齒狀回、杏仁核中的某些決定神經可塑性的蛋白質增加有關[62]，如過氧化物酶體增殖劑激活受體（Peroxisome Proliferator Activated Receptor y，PPARy）、磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、突觸素（Synaptophysin）和胱天蛋白酶9（Caspase-9）等表達上調，這一結果在高通量測序中得到驗證（論文待發表）。實驗結果還發現，有氧運動調控了海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的變化，且這一變化與TUENL陽性細胞的表達相適應。

有研究表明，miR-195高表達于機體腦部，且在乳腺[63-64]、前列腺[65-66]、子宮內膜[67]、消化道如大腸[68-69]等的細胞增殖與凋亡中發揮重要作用，尤其是在腦神經膠質瘤方面的作用[70-71]，倍受關注。研究人員發現，上調miR-195在多種腫瘤中具有抗腫瘤增殖與轉移的作用，一方面，可抑制腫瘤細胞增殖，削弱平板克隆形成能力，促進細胞凋亡[72]，另一方面參與腫瘤的生長[73]、增殖[74-75]、凋亡[76]、侵襲與遷移[77]等的調節。miR-195除參與腫瘤細胞的凋亡與轉移外，是否參與其他慢性病的細胞凋亡？有研究顯示miR-195抑制劑可顯著降低缺氧和H2O2處理的心肌細胞凋亡，提高細胞活力[78-79]，同樣在心肌缺血再灌注損傷實驗中，miR-195的過表達除可降低Bcl-2mRNA的蛋白表達外，還增加Bax、Cyt、Caspase-3和Caspase-9mRNA的蛋白表達，相反下調miR-195可增加Bcl-2 mRNA的表達，降低Bax mRNA的表達[80]。張帥等[81]的研究發現miR-195以多靶點調控的方式參與血管性癡呆動物模型神經元突觸退化與神經元死亡的發生與發展過程；相似的研究還包括，miR-195的表達被抑制后引起小鼠在Morris水迷宮中潛伏期延長，穿越平臺位置的次數明顯減少[82]。因此，miR-195除了參與腫瘤細胞的增殖與凋亡外，在神經細胞的凋亡及海馬功能調節中發揮重要作用。推測miR-195可能參與海馬神經元的增殖與凋亡過程。因此認為，miR-195的高表達易引起海馬神經元凋亡，減弱海馬功能。運動作為機體內源性物質表達分泌的重要途徑，是否能通過直接或間接信號通路誘導miR-195的差異表達？這方面的研究鮮有報道。

本研究發現，BDNF有可能抑制miR-195的表達水平，阻止海馬神經凋亡。由于實驗條件限制，未能進行miR-195模擬物或抑制劑轉染后檢測BDNF蛋白的表達以及BDNF阻斷后的miR-195表達情況，但已有的文獻[83]報道顯示miR-195可能負調控BDNF蛋白的表達，彌補前額葉γ-氨基丁酸能mRNA缺陷，miR-195與BDNF呈顯著性負相關。本實驗結果顯示系統的有氧運動可顯著增加CUMS抑郁小鼠海馬BDNF的表達，下調miR-195的差異表達，二者也呈顯著性負相關。CUMS抑郁小鼠海馬組織的RT-PCR檢測結果還顯示miR-195還可以通過抑制Bcl-2的表達增強活化Caspase的凋亡過程，而有氧運動可以逆轉這一過程。有氧運動誘導的miR-195與Bcl-2表達水平的相關性分析發現，二者存在負相關關系。因此推測，系統的有氧運動可能通過激活抑郁小鼠海馬組織BDNF的表達水平，下調miR-195的表達，進一步增強抗凋亡基因Bcl-2的表達水平，拮抗Bax、Caspase等促凋亡因子的差異表達，發揮拮抗神經細胞凋亡，改善海馬神經功能。

4 結論

CUMS抑郁小鼠海馬功能降低，可能通過miR-195的上調靶向抑制Bcl-2，使促凋亡因子表達增高，促進海馬細胞凋亡的發生。有氧運動可顯著提高抑郁小鼠海馬BDNF的表達，抑制miR-195的促凋亡作用，降低促凋亡因子的表達水平，發揮抗凋亡作用。有氧運動改善抑郁小鼠海馬功能，發揮海馬保護效應，可能與BDNF/miR-195/Bcl-2信號通路的激活有關。但miR-195模擬物或抑制劑以及BDNF增強劑是否能夠阻斷或增強該信號通路的調控作用，進一步發揮對海馬神經細胞的抗凋亡的作用機制有待進一步研究。