不同制劑對茖蔥種子發芽和直接分化不定芽誘導的影響

張麗娟　曲繼松　朱倩楠　李堃

摘 要： 為探索茖蔥種子萌發條件及其對PEG-8000處理的響應，同時測定不同生長調節劑配方對茖蔥不定芽分化的影響。以前一年和當年茖蔥種子為材料，采用培養皿濾紙卷法進行種子萌發試驗；以茖蔥鱗莖為外植體進行不定芽誘導分化。結果表明，10%（w）的PEG-8000處理可明顯促進前一年茖蔥陳種子發芽，發芽率94.00%、發芽指數0.89。隨PEG-8000質量分數的增加，茖蔥種子的發芽率、發芽勢及發芽指數有所降低；低溫層積50 d及PEG-8000浸種能顯著促進茖蔥當年新種子萌發，沙藏層積50 d，再用200 mg·L-1 PEG-8000浸種4 h，發芽啟動時間及發芽高峰期提前最多，發芽持續時間縮短10 d左右，與CK相比，發芽勢、發芽率及發芽指數分別提高了475.00%、65.52%及93.75%，對促進茖蔥種子發芽的效果最好，同時PEG-8000浸種能顯著減少種子層積后的爛種數。篩選出MS+6-BA 1.5 mg·L-1 +2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1為供試方案中的最優培養基配方，分化率為56.56%。

關鍵詞： 茖蔥； 種子發芽； PEG-8000； 直接分化； 不定芽誘導

Effect of different preparations on induction of adventitious buds on the germination and direct differentiation of Allium victorialis L. seeds

ZHANG Lijuan， QU Jisong， ZHU Qiannan， LI Kun

（Institute of Germplasm Resources， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Science， Yinchuan 750002， Ningxia， China）

Abstract： In order to explore the germination conditions of the seeds and the response to PEG-8000 treatment， and the effect of different plant growth regulator combinations on Allium victorialis L. adventitious buds induction， Allium victorialis L. seeds of last year and the new one were taken as materials. The seed germination test was carried out with culture dish filter paper. Bulbs of Allium victorialis L. were used as explants for adventitious buds inducted differentiation. The results indicated that the 10% PEG-8000 treatment can obviously promote the germination of old seed. The germination rate was 94.00% and the germination index was 0.89. The germination rate， germination potential and germination index were decreased with the increasing the concentration of PEG-8000. The cold stratification of 50 days and PEG-8000 immersion can significantly promote the germination of the new seeds.The immersion for 4 h with 200 mg·L-1 PEG-8000 after 50 days of sand accumulation layer ， can make the start time and the peak of germination come earlier. The period of germination was reduced by 10 days， compared with CK， germination potential， germination rate and germination index increased by 475.00%， 65.52% and 93.75% respectively， the promotion effect of seed germination was the best. At the same time， PEG-8000 immersion can significantly decreased the number of decomposed seeds after lamination. The formula of MS+6-BA 1.5 mg·L-1+ 2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1 was selected as the optimal medium in the test， and the differentiation rate was 56.56%.

Key words： Allium victorialis L.； Seed germination； PEG-8000； Direct differentiation； Adventitious buds induction

茖蔥（Allium victorialis L.）為百合科（Liliaceae）蔥屬多年生草本植物，別名寒蔥、鹿耳蔥、隔蔥等，全株可供食用，為藥食兼用植物，其蔥香味濃，并略帶爽口野味，為一種珍稀山野菜[1]。近年來，由于其特殊的營養及藥用價值日益受到人們的重視[2-4]。茖蔥生長環境特殊，供應周期較短，季節性強，繁育能力差，連根挖起的采集方式致使野生茖蔥資源遭到嚴重破壞，數量急劇減少[5-7]。茖蔥的實生繁殖較困難，正常條件下茖蔥種子發芽慢且所需時間長，具有上胚軸休眠特性。茖蔥分株繁殖同樣較困難，很難得到大量繁殖體[8]。茖蔥產業在我國還比較落后，不能充分有效地保證市場日益擴大的需求。目前我國關于茖蔥繁殖的研究報道較少，茖蔥種子萌發慢、不整齊的特性仍需進一步改善；另外，組織培養是茖蔥進行無性快速繁殖的方法之一。筆者對茖蔥種子進行不同生長調節劑配方處理，通過種子發芽試驗篩選最優處理方式；通過應用不同培養基配方進行茖蔥不定芽誘導，探索茖蔥直接分化不定芽誘導的最佳培養基，以期為茖蔥的有性、無性繁殖以及規模化的人工馴化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

茖蔥種子采集于吉林農業大學蔬菜試驗基地，經吉林農業大學園藝學院宋述堯教授鑒定。發芽試驗時間為2016年10月，試驗一的種子為2015年采集的陳種子，試驗二的種子為當季新種子；不定芽誘導的茖蔥材料于2017年4月中旬采自寧夏農林科學院園林場綜合試驗基地馴化栽培的茖蔥全株（2015年10月引自吉林）。

1.2 種子處理

將茖蔥種子設置PEG-8000和PEG-8000+層積處理2個試驗，種子萌發采用培養皿濾紙卷法進行。

試驗一：將茖蔥干種子均勻排布于墊有2層無菌濾紙的培養皿居中位置，CK的茖蔥種子經去離子水浸泡12 h，濾紙及種子分別用PEG-8000 10%（t1）、20%（t2）、30%（t3）以及去離子水（CK、CK）始終保持濕潤，將濾紙兩端卷起重疊使成卷狀。恒溫培養箱培養，溫度設定為20 ℃，光照3 000 lx每天照明10 h。

試驗二：層積后PEG-8000處理。層積處理以細沙為介質，將細沙用清水反復洗凈，在105 ℃下消毒24 h后備用。干種子經0.3% KMnO4溶液浸種消毒15 min，去離子水洗凈，種子與濕沙按1∶3的體積比混合，沙子濕度以手握成團、松開不散為宜[9]，裝入自封袋，置于4 ℃冰箱中冷藏。冷藏結束后，具體處理見表1，種子萌發方法同試驗一的CK。每處理50粒種子，3次重復。

1.3 種子萌發的測定

種子萌發以胚根長達2 mm為標志。種子開始萌發之日起，每5 d觀測并記錄種子的萌發狀況，將已萌發的種子及時取出，播種于已消毒的細沙作介質的育苗盤。連續5 d無種子萌發則視為萌發結束。按李暢等[10]的方法計算發芽啟動時間、發芽率（GR）、發芽指數（GI）、發芽勢（GE）等。

①發芽啟動時間：指從萌發試驗開始到第1粒種子開始萌發所持續的時間；

②發芽持續時間：種子開始萌發到最后1粒種子萌發的總時間；

③發芽率（GR）/%=種子發芽總數/供試種子總數×100；

④發芽指數（GI）=∑（Gt·Dt-1），其中Gt為t日內的發芽數，Dt為相應的發芽天數；

⑤發芽勢（GE）/%=種子發芽高峰時的發芽種子數/供試種子總數×100；

采用Excel 2003和DPS 7.05對試驗數據進行單因素方差分析，采用最小顯著差數法（LSD）比較差異顯著性。

1.4 不定芽誘導材料處理

用自來水沖去茖蔥外植體上的灰塵和泥土，用軟毛刷配合洗潔精溶液刷洗外植體表面，除去附著在表面的部分菌體，然后用流水沖洗40 min[8]。在超凈工作臺上切取鱗莖，放入75%酒精中消毒30 s，然后轉入0.1% HgCl2溶液中消毒8 min，再用無菌水沖洗6次，用無菌濾紙吸干外植體上的水分，切除與消毒液接觸的傷口部位，并將幼嫩鱗莖切成0.5～0.8 cm小段，以備接種。

培養基的配制：以MS培養基為基本培養基，0.7%的瓊脂，3%的蔗糖，pH調至5.8，添加生長調節劑，用不同濃度的生長調節劑（6-BA和2，4-D）處理，培養基配方見表4。

采用組培瓶培養，每瓶裝30 mL培養基，每瓶接種2塊，接種20瓶，3次重復。培養條件：溫度23 ℃、濕度65%；光照條件為：首先暗培養14 d，轉為光照2 500 lx，光期14 h/暗期10 h。調查不定芽開始分化的時間，30 d后觀察并統計不定芽誘導數目及生長情況。

不定芽分化率/%=不定芽誘導數/接種數（除去污染）×100。

參考唐銘[11]的研究結果，茖蔥誘導出不定芽30 d 后將不定芽繼代培養，60 d 后進行增殖培養，將苗高約1.5 cm的健壯芽苗進行生根培養，最后完成茖蔥不定芽分化的再生體系。

2 結果與分析

2.1 種子萌發測定

2.1.1 不同質量分數PEG-8000對茖蔥種子發芽情況的影響 從表2可知，CK、t1、t2的發芽啟動時間為50 d，CK和t3的發芽啟動時間為60 d；CK和t3的發芽持續時間為20 d，t1、t2的發芽持續時間為25 d，CK持續時間最長為30 d；發芽率t1最高為94.00%，t2與t1無顯著差異，CK與t2無顯著差異，CK最低為72.67%；發芽指數方面，t1最高為0.89，顯著高于t2和CK，t2和CK無顯著差異，CK和t3的發芽指數較低，且二者無顯著差異。由圖1可以看出，t2的發芽高峰期在56～65 d，其發芽勢為70.00%；61～70 d內，t1的發芽勢最高為76.00%；t3和CK的發芽高峰期均在66～75 d內，其發芽勢分別為72.00%和66.00%，同時此時間段內t1的發芽勢仍然最高，為74.00%。

10%和20%的PEG-8000處理的茖蔥種子發芽啟動時間早，發芽持續時間較短，發芽率高，而10%的PEG-8000處理發芽勢和發芽指數均明顯高于20%的PEG-8000處理；去離子水浸泡12 h的茖蔥種子發芽啟動時間早，但發芽持續時間較長；CK和30%的PEG-8000處理的茖蔥種子發芽啟動時間晚，發芽持續時間短，但發芽高峰期最晚，發芽率、發芽勢及發芽指數均較低。

2.1.2 層積及PEG-8000浸種對茖蔥種子發芽情況的影響 表3中T 5發芽啟動時間最早，47 d即開始萌發，同時發芽持續時間最短，僅63 d；CK開始萌發的時間最長為50 d；茖蔥種子發芽高峰期，除PCK和PT3外，其他處理均在47～55 d內，此時間段內的發芽勢PT5最高為92.00%，其次是PT4為80.00%，PT1、PT2、PT3無顯著差異，PCK最低為16.00%；PT5 的發芽數最多，發芽率和發芽指數均最高，分別為96.00%和0.93，PT4與PT5無顯著差異，其次是PT3 、PT2和PT1，PCK發芽率和發芽指數均最低，分別為58.00%和0.48；PT1的爛種數最多，為6.67粒，PT5的爛種數最少，為1.67粒。

可見，茖蔥種子低溫層積50 d及PEG-8000浸種能顯著促進茖蔥種子萌發，使發芽啟動時間及發芽高峰期均提前，顯著提高了發芽率、發芽勢及發芽指數，同時PEG-8000浸種能顯著減少種子層積后的爛種數。其中PT5 處理即種子沙藏層積后4℃冰箱保鮮50 d，再用200 mg·L-1 PEG-8000浸種4 h對促進茖蔥種子發芽影響最大。

2.2 生長調節劑組合對茖蔥不定芽誘導的影響

植物生長調節劑在茖蔥直接分化再生體系的過程中至關重要，不定芽的產生與培養基中生長素（2，4-D）和細胞分裂素（6-BA）的比例有關，在二者配合使用的情況下，對茖蔥不定芽分化的影響存在較大差異。MS 培養基可使鱗莖直接誘導分化出不定芽，在培養15 d后開始從切口邊緣長出淺黃色的芽（圖2）。由表4可以看出，2，4-D質量濃度較低時（1.0 mg·L-1），6-BA質量濃度為1.5 mg·L-1時（ST2），芽的誘導和生長情況最優，高于（ST1，2.0 mg·L-1）和低于（ST3，1.0 mg·L-1）此濃度都與其產生顯著差異；2，4-D質量濃度較高時（2.0 mg·L-1），仍是6-BA質量濃度為1.5 mg·L-1時（ST4）芽的誘導和生長情況顯著優于1.0 mg·L-1（ST5）；但ST2和ST4除開始分化時間無顯著差異外，ST2的不定芽分化率（56.56%）和莖芽高（3.86 mm）均顯著高于ST4，生長情況也明顯優于ST4。可見，ST2的生長調節劑組合，即MS+6-BA 1.5 mg·L-1 +2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1培養基配方不定芽分化快，叢生芽多，生長狀況好，分化率高，最適合茖蔥不定芽的誘導和生長。

表4 不同生長調節劑組合對茖蔥不定芽誘導及生長的影響

[處理 ρ（生長調節劑）/

（mg·L-1） 開始分化

時間/d 不定芽分

化率/% 莖芽

高/mm 生長情況 6-BA 2，4-D KT ST1 2.0 1.0 0.1 18.33 A 9.44 E 1.56 E 細弱（+） ST2 1.5 1.0 0.1 14.67 C 56.56 A 3.86 A 粗壯（++++） ST3 1.0 1.0 0.1 17.67 AB 33.78 C 2.00 C 中等（++） ST4 1.5 2.0 0.1 15.33 C 40.44 B 3.27 B 較粗壯（+++） ST5 1.0 2.0 0.1 18.00 A 18.89 D 1.86 D 細弱（+） ]

[注] 生長情況以“+”表示，“+”越多表示長勢越好。

3 討論與結論

茖蔥種子正常條件下發芽慢，所需時間長，種子自然繁殖能力弱。王明焱等[12]研究認為，茖蔥種子萌發受溫度因子影響較大，建議選擇20 ℃為發芽最適溫度。張忠寶等[6]的研究結果證明，茖蔥種子中存在抑制種子發芽的物質，其抑制物不僅能抑制其他種子的發芽，也對其自身具有抑制作用，其抑制物可能是使茖蔥種子長時間休眠的重要原因之一。宋發軍等[13]研究不同質量分數的PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000和PEG-10000 對華重樓種子萌發的影響，其中25% PEG-4000 和25% PEG-8000浸種能有效打破華重樓種子休眠并促進種子萌發。張忠寶等[14]的結果為低溫層積處理30～45 d和激素處理（GA3 100～150 mg·L-1、NAA 5 mg·L-1）浸種24 h均可顯著提高茖蔥種子發芽率。在筆者的研究中，前一年的茖蔥陳種子不經過其他處理可以正常發芽，但發芽啟動時間晚（60 d），持續時間長（80 d），發芽率、發芽勢及發芽指數均較低，經去離子水浸種12 h和PEG-8000處理均能促進茖蔥種子萌發，浸種能使發芽啟動時間提前，隨PEG-8000質量分數的增加，茖蔥種子的發芽率、發芽勢及發芽指數有所降低，其中10%的PEG-8000處理可明顯促進茖蔥種子發芽；茖蔥當年新種子不進行層積處理亦能發芽，但低溫層積50 d及PEG-8000浸種能顯著促進茖蔥種子萌發，使發芽啟動時間及發芽高峰期均提前，顯著提高了發芽率、發芽勢及發芽指數，同時PEG-8000浸種能顯著減少種子層積后的爛種數。其中種子沙藏層積后4 ℃冰箱保鮮50 d，再用200 mg·L-1 PEG-8000浸種4 h對促進茖蔥種子發芽的效果最好。2個發芽試驗中，茖蔥種子發芽均較唐銘[11]、王明焱[12]、張忠寶等[13]的持續時間短，發芽高峰期提前。試驗同時將已萌發的種子播種于細沙作介質的育苗盤中育苗，所有種子均能正常出苗，且長勢無差異。

茖蔥不定芽誘導是組培快繁過程中的最重要階段，筆者篩選出MS+6-BA 1.5 mg·L-1 + 2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1為供試方案中的最優培養基配方。與劉霞等[11]培養基成分為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1（t1）適合不定芽誘導的試驗結果略有不同，但理論是一致的，即芽生長情況因6-BA和2，4-D的比值發生變化而變化，當6-BA質量濃度較低時，芽長勢細弱纖小，隨著6-BA質量濃度上升，長勢變強，但到達一定質量濃度后，長勢逐漸變弱。本次試驗優化了茖蔥組織培養不定芽誘導階段培養基配方，為后續不定芽增殖與生根奠定了基礎。

參考文獻

[1] 曲繼松，宋述堯.茖蔥研究進展[J].特產研究，2006（4）：69-72.

[2] 趙懷清，王學婭，難波恒雄.茖蔥中含硫化合物對培養心肌細胞的作用[J].藥學學報，2000，35（1）：4-6.

[3] KIM Y S，JUNG D H，LEE I S，et al.Effects of Allium victorialis leaf extracts and its single compounds on aldose reductase，advanced glycation end products and TGF-beta1 expression in mesangial cells[J].BMC Complementary and Alternative Medicine，2013，13（3）：838-839.

[4] 李倩竹，趙玉娟，劉喬，等.不同采摘時期長白山野生茗蔥功效成分質量分數變化規律分析及降血脂作用研究[J].中山大學學報（自然科學版），2015，54（3）：125-129.

[5] 曲繼松.長白山茖蔥主要生物學特性研究[D].長春：吉林農業大學，2007.

[6] 張忠寶，劉麗艷，張雷，等.茖蔥種子抑制物質的初步研究[J].種子，2012，31（1）：49-52.

[7] CHOI S T，LEE J T，PARK W C.Dormancy physiology，softening culture and evaluation of nutrition value in the Ulrung-native Allium victorialis var.platyphyllum[J].Journal of the Korean Agricultural Chemical Society（Korea Republic），1993，36（6）：495-501.

[8] 劉霞，唐銘，許永華，等. 茖蔥不定芽分化的再生體系[J].吉林農業大學學報，2015，37（4）：434-439.

[9] 張忠寶，劉麗艷，許善花. 長白山茖蔥生長習性及栽培技術[J].北方園藝，2011（4）：76-77.

[10] 李暢，蘇家樂，陳璐，等. 長白山區 6 種杜鵑花屬植物種子形態及萌發特性[J].揚州大學學報（農業與生命科學版），2011，32（4）：59-63.

[11] 唐銘.茖蔥有性繁殖與無性繁殖的初步研究[D].長春：吉林農業大學，2015.

[12] 王明焱，徐連杰，楊利民. 茗蔥種子萌發的生態學特性研究[J].北方園藝，2011（7）：35-37.

[13] 宋發軍，余曉東，劉佳，等. 激素和 PEG 對華重樓種子萌發的影響[J].中南民族大學學報（自然科學版），2015，34（2）：14-17.

[14] 張忠寶，劉麗艷，黃城秀，等. 茖蔥種子繁殖特性及不同處理對種子發芽的影響[J].北方園藝，2010（3）：32-34.