miR-106b對脂多糖誘導活化的人單核巨噬細胞分泌TNF-α的影響及機制研究

陳軍 周盈盈 陳黎黎 趙初環

冠狀動脈粥樣硬化嚴重危害人類健康，闡明其發病機制是當前亟待解決的重大問題[1]。目前，冠狀動脈粥樣硬化是一種炎癥過程的論點已經被普遍認可[2-3]。其中，人單核巨噬細胞（THP1）主導的炎癥反應在冠狀動脈粥樣硬化的發生、發展中發揮著關鍵的作用，但其炎癥反應調節機制尚未完全闡明[4]。TNF-α是主要由人THP1分泌的促炎癥細胞因子，它可以直接或間接損害血管內皮，促進血管炎癥及血栓形成。研究證實，在冠狀動脈粥樣硬化的過程中，TNF-α起著重要作用[5]。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來被發現參與心血管調節的一類非編碼小RNA[6]，研究表明miRNA對炎癥具有重要的調節作用[7]。前期我們通過miRNA基因芯片，分析對比了人THP1活化前后miRNA的表達譜變化，發現人THP1活化后miR-106b出現高表達。因此，本文擬在脂多糖（LPS）誘導人THP1炎癥反應的細胞模型中，研究miR-106b對人THP1分泌TNF-α的調節作用及其可能機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑 THP1由中國科學院典型培養物保藏委員會上海細胞庫提供；FBS（美國Gbico公司)；RPMI 1640培養基、Opti-MEMI培養基、脂質體2000（美國Invitrogen公司）；LPS（TLR4刺激劑，美國 Sigma公司）；miR-106b mimic、NC mimic（上海吉瑪生物有限公司）；人TNF-αELISA試劑盒（美國Ebioscience公司）；miRNA逆轉錄及定量PCR試劑盒（美國應用生物系統有限公司）；抗SIRPα-APC熒光標記抗體（美國BD公司）。

1.2 細胞培養及刺激 將THP1細胞用1640完全培養基培養于 24孔板，LPS 1μg/ml刺激。分別于 0、6、12h 收集細胞，Trizol法抽提RNA，熒光定量PCR檢測miR-106b表達量；于24h后收集細胞上清液，測上清液TNF-α表達量，另設陰性對照進行比較。

1.3 分組和miRNA轉染 重新取THP1細胞，分為LPS組、NC對照組和miR-106b組3組。LPS組，THP1細胞不轉染，單用 LPS（1μg/ml）刺激 24h；NC 對照組，每孔細胞中加入NC mimic（與靶基因序列不相符）100nmol轉染后，LPS（1μg/ml）刺激 24h；miR-106b 組，每孔細胞中加入miR-106b mimic 100nmol轉染后，LPS（1μg/ml）刺激 24h。實驗嚴格按照 Invitrogen公司Lipofectamin2000說明進行操作:（1）miRNA和Lipofectamin2000（1μl/孔）分別溶于 50μl的 opti-MEM 無血清培液中5min，混勻；（2）將上述兩者等體積混勻15 min；（3）將上述混合液按照每孔 100μl加入細胞中；（4）培養4h后，更換為完全培養基，加入1μg/ml的LPS刺激24h，然后收集細胞進行后續實驗。LPS(1μg/ml)刺激24h后，檢測各組THP1細胞上清液TNF-α的表達量。

1.4 miRNA靶蛋白預測 為進一步明確miR-106b在THP1細胞分泌TNF-α異常的通路中可能的作用機制，我們采用在線預測靶點工具Targetscan version5.1生物信息學分析系統初步預測其可能的靶蛋白以及它們可能的作用位點，預測miR-106b可能調控的靶基因。

1.5 流式細胞儀檢測樣本細胞靶蛋白表達量 每個樣本均準備兩份，每份1×105個細胞，約20~30μl體積。LPS組、NC對照組、miR-106b組均加入0.3μl用APC標記的抗SIRPα抗體染色；另設陰性對照組（neg組，不染色），4℃孵育30min左右。用1ml加有0.2%FBS的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌上述反應混合液，1 700r/min離心5min，重復上述步驟1次。然后用200μlPBS懸浮細胞，流式細胞儀上機檢測。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料均以表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，方差齊者兩兩比較采用LSD-t檢驗,方差不齊者采用 Tamhane′sT2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。作圖采用GraphPad Prism 6軟件。

2 結果

2.1 LPS刺激 0、6、12h后 THP1細胞 miR-106b的表達水平比較 見圖1。

圖1 LPS刺激0、6、12h后THP1細胞miR-106b的表達水平比較

由圖 1可見，LPS刺激 6、12h后 THP1細胞miR-106b表達水平均明顯升高（均P＜0.01），且6h時＞12h時（均P＜0.01）。

2.2 LPS刺激24h后THP1細胞上清液TNF-α表達水平比較 見圖2。

圖2 LPS（1μg/ml）刺激 24h后THP1細胞上清液TNF-α表達水平比較（**P＜0.01）

由圖 2 可見，LPS（1μg/ml） 刺激 24h 后，LPS 組THP1細胞上清液TNF-α表達水平與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），提示采用TLR4刺激劑LPS活化THP1細胞的體系構建成功。

圖3 3組細胞上清液TNF-α表達水平比較（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 3組細胞上清液TNF-α表達水平比較 見圖3。

由圖3可見，與LPS組和NC對照組比較，miR-106b組THP1上清TNF-α表達水平明顯增多（均P＜0.05）；NC對照組與LPS組相比無統計學差異（P＞0.05）。

2.4 生物信息學預測miR-106b作用靶蛋白 經Targetscan Version 5.1生物信息學分析系統初步預測，其可能的靶蛋白為信號調節蛋白α（SIRPα），它們可能的作用位點見圖4。

圖4 miR-106b作用靶蛋白及作用位點預測（矩形圖為miR-106b靶基因SIRPα mRNA結構圖，miR-106b可與 SIRPα5'UTR區結合而發揮調控作用，target site為miR-106b作用于SIRPα時的結合位點GCACUUU）

2.5 流式細胞儀檢測各組THP1細胞SIRPα表達水平 見圖5。

圖5 檢測各組THP1細胞SIRPα表達水平的流式細胞圖

由圖5可見，與NC對照組和LPS組比較，miR-106b組的THP1細胞SIRPα表達水平明顯下降（均P＜0.05）。

3 討論

本研究通過體外脂質體轉染過表達miR-106b等方法，發現該miRNA可促進人THP1分泌TNF-α。為進一步明確miR-106b在THP1分泌TNF-α異常的通路中可能的作用機制，采用生物信息學分析初步預測其可能的靶蛋白為SIRPα，并采用流式細胞儀檢測證實miR-106b可通過抑制靶蛋白SIRPα表達，進而促進THP1細胞活化后分泌TNF-α的量。miRNA是近年發現的一類長約19～22個堿基的單鏈非編碼小分子RNA。研究顯示，miRNA是一類重要的負調控因子。成熟的miRNA通過核酸序列互補結合到靶mRNA非編碼區來抑制翻譯或促進靶mRNA的降解，從而起到負調節作用，其在固有免疫，適應性免疫及炎癥因子的信號轉導過程中都起著重要作用[8-9]。

已有研究顯示，miRNA參與調控心血管疾病的發病過程。研究證實，miRNA可以通過細胞和分子水平來改變靶基因的表達，進而參與調控心血管相關的一些重要生物學過程，包括血管的形成、細胞的分化和增殖以及凋亡等[10]。同時，研究表明，miRNA也可調控心血管疾病相關炎癥因子的表達。Zhu等[7]研究發現，miR-155可以通過抑制氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導的巨噬細胞表達TNF-α、IL-6等炎癥因子，進而抑制動脈粥樣硬化的發生和發展。Sun等[11]研究發現，體內過表達miR-181b可以抑制載脂蛋白E敲除（apolipoprotein-E deficiency，ApoE-/-）小鼠體內 TNF-α、IL-1β 等促炎癥因子的表達，抑制小鼠動脈粥樣斑塊的形成。目前對miR-106b的功能研究主要集中在腫瘤免疫方面。miR-106b可以通過作用于腫瘤抑制基因 RBL1、RBL2、CASP8增加膠質瘤的發生率[12]。而其過表達可以通過激活上皮-間質轉變促進肝癌細胞的遷移和轉移[13]。近年來，Tang等[14]研究發現，miR-106b還可以對樹突狀細胞起調控作用。miR-106b可以抑制卵清蛋白誘導的樹突狀細胞的促過敏及隨后的Th2細胞的極化，對過敏性炎癥性疾病具有治療作用。而樹突狀細胞已被證實在動脈粥樣硬化過程中起著重要作用。在ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠模型中，漿細胞樣樹突狀細胞起到關鍵的促動脈粥樣硬化作用，而通過清除小鼠體內漿細胞樣樹突狀細胞，可以明顯減少動脈粥樣硬化斑塊的形成[15]。目前尚無關于miR-106b對動脈粥樣硬化或巨噬細胞炎癥直接調控作用的相關研究。

此外，本研究通過生物信息學分析技術預測miR-106b可能的潛在靶基因為SIRPα，并通過流式細胞檢測進一步從蛋白水平證實了miR-106b可以抑制THP1細胞膜表面蛋白SIRPα的表達。SIRPα是屬于免疫球蛋白超家族的I型跨膜受體，可表達于單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞胞、樹突狀細胞、內皮細胞等胞膜上[16]。研究發現，SIRPα與其配體CD47作用可以抑制巨噬細胞的吞噬作用[17]。CD47融合性蛋白可以通過作用于CD172a+（SIRPα）細胞抑制克羅恩病模型小鼠IL-1β和TNF的分泌[18]。因此，SIRPα在巨噬細胞以及其炎癥反應中發揮了重要作用。研究顯示，巨噬細胞及其炎癥反應在動脈粥樣硬化形成過程中扮演著重要角色。巨噬細胞可通過分泌單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1），募集單核細胞和更多的巨噬細胞到血管壁，導致動脈粥樣硬形成[19]。Liu等[20]發現，SIRPα可以抑制β2整合素介導的人THP1的黏附、遷移和吞噬作用，進而可能抑制動脈粥樣硬化早期血管壁上的人THP1過度激活與聚集。

本研究通過采用體外LPS誘導活化人THP1細胞，發現活化的THP1細胞可分泌大量TNF-α。體外過表達miR-106b后，其可促進THP1細胞分泌TNF-α。本研究闡明了miR-106b在人THP1分泌TNF-α過程中的作用，拓寬了對miRNA在調控巨噬細胞炎癥網絡的了解，有助于進一步了解動脈粥樣硬化相關疾病，特別是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發病機制，并為此類疾病的分子靶向治療提供理論依據。