β淀粉樣蛋白誘導大鼠視網膜神經節細胞凋亡

鄔羽飛，宋勝仿，劉世純，李 華，周文君

(重慶醫科大學附屬永川醫院 眼科，重慶 402160)

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)的病理特征是視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)的改變和RPE及Bruch膜之間玻璃膜疣的沉積，但其具體發病機制仍不清楚。玻璃膜疣的一種重要組成成分為β淀粉樣蛋白(amyloid-beta，Aβ)。Aβ具有細胞毒性，其在視網膜中的增高、聚集參與了早期AMD的視網膜損傷[1]。然而，由于玻璃膜疣多沉淀在RPE基底膜和Bruch膜內膠原層之間，前期研究多數為Aβ對RPE毒性作用的研究[2-4]。

最近研究發現，視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)層和RPE細胞層均為視網膜Aβ合成和分泌的主要來源[5-6]。目前已證實Aβ對RPE的損傷作用，但Aβ在視網膜神經纖維層的異常沉積對RGC細胞是否會造成損傷及其機制尚不明確。p38 MAPK為應激激活的激酶，參與了多種因素導致的神經細胞凋亡。因此，本研究擬在大鼠玻璃體腔中注射Aβ1-42，在體觀察Aβ1-42對視網膜RGC的損傷作用及其方式，并初步探討潛在的損傷機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Aβ1-42(Sigma-Aldrich公司)；單克隆兔抗鼠Aβ1-42抗體、Cy3猴抗兔IgG、單克隆羊抗鼠Brn3a抗體、Alexa Fluor-568猴抗羊IgG、多克隆兔抗鼠caspase-3抗體及相應Cy3猴抗兔二抗IgG(Cell Signaling Technology公司)；山羊血清和胎牛血清(Biological Industries公司)；綠色熒光標記原位凋亡檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；單克隆兔抗P-p38抗體及單克隆兔抗p38抗體(武漢博士德生物技術公司)；BCA蛋白質測定試劑盒、蛋白質裂解液RIPA及過氧化物酶標記羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術公司)；Immobilon Western發光液和PVDF膜(Millipore公司)；p38 MAPK抑制劑SB203580(Merck公司)；SPF級6～8周雌性SD大鼠，體質量220～250 g[重慶醫科大學動物實驗中心，SYXK(渝)2007-0001]。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理：將大鼠隨機分為對照組(于大鼠右眼玻璃體腔注射5 μL PBS溶液)、實驗組[于大鼠右眼玻璃體腔注射5 μL Aβ溶液(1.4 g/L)]和干預組[于大鼠右眼玻璃體腔注射5 μL SB203580(10 μmol/L)，24 h后注射5 μL Aβ溶液(1.4 g/L)]，每組大鼠各20只。注射完畢后7 d脫頸處死大鼠，摘除眼球。

1.2.2 Aβ的免疫熒光染色：用4%多聚甲醛溶液固定大鼠眼球4 h，去除眼前節，梯度乙醇脫水，OCT包埋，行與視神經矢狀軸平行的視網膜連續切片，制作10 μm厚度的冰凍切片。切片晾干后用PBS溶液清洗3次，每次5 min，2%的山羊血清封閉30 min，加入含有 1∶200的單克隆兔抗Aβ抗體溶液，4 ℃過夜。過夜后的一抗用PBS溶液清洗3次，加入二抗混合液孵育2 h，再次用 PBS 溶液清洗，DAPI復染，封片。

1.2.3 視網膜神經節細胞的免疫熒光染色及計數：用4%的多聚甲醛溶液固定大鼠眼球4 h，去除眼前節，完整取出視網膜。以視乳頭為中心點在 2、4、6、8、10和12點鐘位剪開視網膜，平鋪于玻片上，用Brn3a抗體和相應的二抗染色，用PBS溶液清洗，DAPI復染，封片。在熒光顯微鏡下，每一張視網膜鋪片距離視盤中心點約1 mm處取6個視野，觀察計數染色陽性的視網膜神經節細胞。

1.2.4 RGC細胞凋亡的檢測：大鼠視網膜冰凍切片制備方法同1.2.2。TUNEL法：按照綠色熒光標記原位凋亡檢測試劑盒說明書進行檢測。標記后切片置于熒光顯微鏡下計數TUNEL陽性細胞。Caspase-3 蛋白表達的檢測: 切片用2%的山羊血清封閉30 min后，加入含有1∶250的多克隆兔抗大鼠caspase-3抗體溶液，過夜后用 PBS 溶液清洗3次，加入二抗混合液孵育2 h，清洗，DAPI染色，封片。切片置于熒光顯微鏡下計數caspase-3陽性細胞數。透射電鏡檢測： 2.5%戊二醛溶液固定大鼠眼球24 h，分離出視網膜，切成1.5 mm ×3 mm小片，以1%四氧化鋨緩沖液固定2 h，PBS磷酸緩沖液沖洗3次，逐級脫水，環氧樹脂包埋，做超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后置于透射電鏡(TEM)下觀察。

1.2.5 Western blot檢測大鼠視網膜p38 MAPK磷酸化水平：分離大鼠視網膜，剪碎后放入離心管，加入RIPA蛋白裂解液后超聲勻漿，離心后取上清液。BCA蛋白定量法行蛋白質定量，以30 μg/孔的濃度進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉膜轉移到PVDF膜上，放入5%脫脂奶粉封閉液中進行封閉1 h，然后分別與抗P-p38(1∶1 000稀釋)、抗p38(1∶1 000稀釋) 4 ℃孵育過夜；次日回收一抗，1×TBST洗3次，每次10 min。山羊抗兔(1∶5 000稀釋)二抗常溫孵育1 h后，1×TBST洗3次，每次10 min，滴加適量ECL反應液檢測各組蛋白表達情況。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Aβ的免疫熒光染色

7 d后，Aβ組視網膜各層中均檢測到Aβ熒光，而強熒光主要分布在視網膜神經上皮層和視網膜感光細胞層中。而在對照組中由于抗體與視網膜中蛋白的非特異性結合，則呈現弱的模糊背景熒光(圖1)。

2.2 視網膜神經節細胞免疫熒光染色及計數

與對照組相比，Aβ組視網膜神經節細胞數量明顯減少(P<0.05)，而SB203580干預后，視網膜神經節細胞數量則未見下降(圖2)。

2.3 視網膜神經節細胞凋亡

各組均可見TUNEL陽性細胞 (綠色熒光)及caspase-3蛋白表達(紅色熒光)。與對照組比較，Aβ組TUNEL和caspase-3陽性細胞數量均明顯增多，而SB203580干預后能明顯減少陽性細胞數量。透射電鏡在Aβ組中發現了視網膜神經節細胞的凋亡征象：細胞核染色質著邊，核裂解(圖3)。

圖1 視網膜組織Aβ免疫熒光染色Fig 1 Immunofluorescent staining of Aβ in retina tissue (×40)

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Aβ group

2.4 磷酸化p38 MAPK蛋白含量變化

與對照組相比，Aβ組P-p38蛋白表達明顯增加。用SB203580干預后，可抑制磷酸化p38通路的活化，即P-p38蛋白表達下降(圖4)。

3 討論

Aβ是一個穿透力強且能靶向神經元的高毒性蛋白，是阿爾茨海默病的一個關鍵分子病理特征，對腦神經元已被證明具有神經毒性。在老齡患者的視網膜中發現，Aβ水平升高與AMD發展的關鍵階段高度相關[7]。Aβ對RPE細胞具有損傷作用，其可上調 RPE 細胞分泌VEGF和IL-8[8]，還可增加線粒體相關活性氧簇的產生。這些都被認為是促進脈絡膜新生血管生成的重要因素[9]。

本研究在大鼠玻璃體腔注射Aβ，發現Aβ可沉積在視網膜神經上皮層，并對視網膜RGC細胞有損傷作用，這與體外實驗研究結果[10]一致。TUNEL實驗顯示，Aβ對RGC細胞的損傷方式為細胞凋亡，透射電鏡下亦觀察到RGC細胞的凋亡征象, 形態上表現為：保持完整膜結構的細胞固縮, 染色質濃縮并邊集, 由膜結構包裹部分細胞核和細胞質形成凋亡小體。

近年來研究表明，p38 MAPK信號通路參與了各種因素導致的神經元凋亡，包括缺血缺氧、高糖、損傷及炎性反應等，是調控細胞凋亡的重要信號傳導通路之一[11]。p38 MAPK被磷酸化后形成P-p38 MAPK而被活化，激活后的P-p38 MAPK進入細胞核內進一步活化下游的轉錄因子、caspase家族成員(caspase-3,6,7)等，磷酸化的轉錄因子引起大量與凋亡有關的基因表達，最終導致神經細胞凋亡的發生。Caspase系統在細胞凋亡過程中起重要作用，其中caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路, 是多種凋亡途徑的共同下游部分[12]。而caspase-3亦是神經細胞凋亡的標志因子。本研究結果顯示：Aβ可導致caspase-3表達升高，進而引起RGC細胞凋亡。于此同時，磷酸化p38 MAPK蛋白表達增加，表明p38 MAPK信號通路被激活。SB203580作用于p38 ATP的結合位點Thr106，使p38 MAPK與ATP失去相互結合能力， 從而失去激酶活性。當加入p38 MAPK信號傳導通路阻斷劑SB203580后，RGC細胞凋亡受到抑制，caspase-3表達亦降低，說明p38 MAPK信號通路在Aβ誘導RGC細胞凋亡過程中起促進作用。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Aβ group圖3 視網膜神經節細胞凋亡檢測及計數

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Aβ group

綜上所述，Aβ可通過激活p38 MAPK信號通路，上調caspase-3的表達，從而誘導RGC細胞調亡，提示Aβ對AMD的發生發展起著重要的作用。