長鏈非編碼RNA GASL1在乳腺癌組織及細胞系中的表達及作用

吳多明，武 力，張曉斌，馬大昌

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 乳腺病科， 甘肅 蘭州 730000)

乳腺癌是嚴(yán)重影響女性健康最常見的惡性腫瘤。分子生物學(xué)快速發(fā)展促使乳腺癌的基因治療成為研究的熱點[1]。探尋與乳腺癌相關(guān)的抑癌基因和促癌基因為乳腺癌的診治提供了新的研究方向[ 2]。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過 200 nt非編碼RNA。研究表明，lncRNA參與包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌的發(fā)生發(fā)展[3]。與乳腺癌發(fā)病、預(yù)后和耐藥等密切相關(guān)的lncRNA不斷被發(fā)現(xiàn)。新近研究發(fā)現(xiàn)了一個新的lncRNA，命名為GASL1(growth-arrest associated lncRNA 1)[4]。GASL1可調(diào)節(jié)人骨肉瘤細胞U2OS的細胞周期，參與細胞增殖和集落形成。且肝癌患者癌組織中GASL1的表達水平與患者的生存周期呈正相關(guān)，上述研究表明GASL1可能是一個新的與癌密切相關(guān)的lncRNA。本研究旨在研究GASL1與乳腺癌的關(guān)系，將開展工作如下：1)GASL1在乳腺癌患者癌組織與癌旁正常組織中的表達差異；2)GASL1對乳腺癌細胞的增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和試劑：正常的人乳腺細胞系 HBL- 100和人乳腺癌細胞系MDA-MB- 231、MDA-MB- 468、MCF- 7 和 SK-BR- 3(ATCC細胞庫)。培基和胎牛血清(BI 公司)。Trizol、RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑(寶生物工程有限公司)。LncRNA GASL1和GAPDH引物、si-GASL1、si-NC、pcDNA3.1、pcDNA3.1-GASL1和 LipofectamineTM2000(廣州銳博生物科技有限公司)。MTT、caspase- 3 活性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。Bax一抗、Bcl- 2一抗和羊抗鼠二抗(Abcam公司)。

1.1.2 樣本收集：隨機選取2015-2016 年在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院進行乳腺癌切除手術(shù)的 30 例乳腺癌患者，所有患者均已經(jīng)過病理學(xué)確診，簽署知情同意書，并由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。切除術(shù)后摘取微量乳腺癌組織(cancer tissues)及癌旁乳腺組織(paracancerous tissue)用于本研究，癌旁組織距離癌組織距離在1 cm左右，凍于-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：用10%胎牛血清高糖DMEM培基培養(yǎng)乳腺癌細胞系(MDA-MB- 231、MDA-MB- 468和SK-BR- 3)及正常乳腺細胞HBL- 100，用10%胎牛血清 RPML1640 培基培養(yǎng)MCF- 7細胞，在 37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染：設(shè)計合成3個lncRNA GASL1 siRNA片段和GASL1過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-GASL1。培養(yǎng)瓶中細胞消化后接種于培養(yǎng)板，待細胞匯合至60%左右時，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染lncRNA GASL siRNA或pcDNA3.1-GASL1至細胞內(nèi)。RT-qPCR檢測其轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 細胞增殖、caspase- 3活力和凋亡相關(guān)蛋白的檢測：用MTT法檢測細胞轉(zhuǎn)染后0、12、24和48 h時的細胞活力(即細胞增殖)，用caspase- 3活性檢測試劑盒檢測caspase- 3，Western blot檢測Bcl- 2和Bax的蛋白表達水平。具體操作參照試劑說明書進行。

1.2.4 RT-qPCR檢測lncRNA GASL1表達：Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。在cDNA中加入PCR熒光試劑和引物于ABI- 7300 PCR儀進行擴增和檢測。ABI- 7300系統(tǒng)分析得到lncRNA GASL表達量。引物序列如下： GASL1上游引物5′-CTGA GGCCAAAGTTTCCAAC-3′，GASL1下游引物5′-CAG CCTGACTTTCCCTCTTCT-3′；GAPDH上游引物5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，GAPDH下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達:收集細胞，加入蛋白裂解液(WIP 裂解液∶PMSF=100∶1)，裂解1 h后離心，吸取上清，加入上樣緩沖液變性(99 ℃，7 min)，運用 BCA 蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。具體操作參照試劑說明書進行。

制備 10%的分離膠和濃縮膠，根據(jù)上述測定的蛋白濃度計算上樣體積(20 μg 總蛋白)，控制電壓和時間(80 V，30 min；120 V，1 h)進行電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，PVDF 膜孵育一抗(Bax和 Bcl- 2，均1∶1 000)4 ℃過夜，TBST漂洗，加入二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗，置于自動顯影儀(ChemiDocXRS 成像系統(tǒng))顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA GASL1表達水平降低

30例乳腺癌患者的癌組織和癌旁正常組織均經(jīng)雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)免疫組化驗證(圖1A)，且發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA GASL1表達水平相對癌旁正常組織降低(圖1B，P<0.05)。

2.2 乳腺癌細胞系中l(wèi)ncRNA GASL1的表達水平降低

相比人正常乳腺細胞HBL- 100，乳腺癌細胞MCF- 7、MDA-MB- 468、MDA-MB- 231和SK-BR- 3中l(wèi)ncRNA GASL1的均表達降低(P<0.05)，且MCF- 7表達水平降低最顯著(圖2)，故選用MCF- 7用于后續(xù)實驗。

2.3 過表達lncRNA GASL1可抑制MCF- 7的增殖，促進其凋亡

相比空白質(zhì)粒(pcDNA3.1)，pcDNA3.1-GASL1能有效的過表達lncRNA GASL1(圖3A)。MCF- 7細胞經(jīng)pcDNA3.1-GASL1過表達GASL1可抑制MCF- 7細胞增殖，且呈時間依賴性(圖3B)。caspase- 3活力、 Bcl- 2和Bax水平是反映細胞凋亡的重要指標(biāo)。過表達lncRNA GASL1可增強caspase- 3活力、減少Bcl- 2表達和增加Bax表達(圖3C～E)，即過表達lncRNA GASL1可促進MCF- 7細胞凋亡。上述一系列實驗結(jié)果表明，過表達lncRNA GASL1可抑制MCF- 7的增殖，促進其凋亡。

A.ER and PR immunohistochemical analysis(×200); B.lncRNA GASL1 expression was down-regulated in breast cancer tissue; *P<0.05 compared with paracancerous tissues

*P<0.05 compared with HBL- 100

2.4 干擾lncRNA GASL1表達可促進MCF- 7增殖，抑制其凋亡

相比無關(guān)序列NC片段，3個siRNA片段均能有效的干擾lncRNA GASL1的表達，其中片段1的干擾作用最強(圖4A)，用于后續(xù)細胞功能研究。MCF- 7細胞經(jīng)siRNA片段1干擾lncRNA GASL1表達可促進MCF- 7細胞增殖，且呈時間依賴性(圖4B)。此外，lncRNA GASL1 siRNA可降低細胞caspase- 3活力、增加Bcl- 2表達和減少Bax表達(圖4C～E)， 即干擾lncRNA GASL1表達可抑制MCF- 7細胞凋亡。上述一系列實驗結(jié)果表明，干擾lncRNA GASL1表達可促進MCF- 7的增殖，抑制其凋亡。

A.transfection with pcDNA3.1-GASL1 significantly up-regulated the expression of lncRNA GASL1; B.transfection with pcDNA3.1-GASL1inhibited the proliferation of MCF- 7; C.transfection with pcDNA3.1-GASL1 increased the activity of caspase- 3; D, E.transfection with pcDNA3.1-GASL1 down-regulated the expression of Bcl- 2 and up-regulated the expression of Bax; pcDNA3.1.empty plasmid; *P<0.05 compared with pcDNA3.1

A.transfection with 3 si-GASL1 segments significantly down-regulated the expression of lncRNA GASL1; B.transfection with si-GASL1 promoted the proliferation of MCF- 7; C.transfection with si-GASL1 decreased the activity of caspase- 3; D, E.transfection with si-GASL1 up-regulated the expression of Bcl- 2 and down-regulated the expression of Bax.si-NC: negative control sequence; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with si-NC

3 討論

人類基因組中70%～90%的基因序列可轉(zhuǎn)錄為RNA， 僅有2% 的 RNA具有編碼蛋白質(zhì)的功能，這些不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA稱為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，根據(jù)長度又可分為短鏈ncRNA(≤200 nt)和長鏈ncRNA(>200 nt)[5]。長鏈ncRNA(lncRNA)作為原癌基因或抑癌基因在乳腺癌中廣泛存在，且與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。

lncRNA HOTAIR 的異常表達是乳腺癌的獨立預(yù)后因素[7]，HOTAIR 在原發(fā)性乳腺癌中的表達量是正常乳腺上皮的 125 倍，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中超過正常乳腺上皮的2 000倍[8]，且 HOTAIR 的過表達與患者遠處轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，將乳腺癌細胞的 MALAT1 基因敲除后，不僅腫瘤細胞的增殖過程被抑制、其侵襲性和轉(zhuǎn)移力也明顯下降[9]。另有研究報道，lncRNA除了參與乳腺癌疾病的發(fā)生發(fā)展還參與乳腺癌耐藥性的調(diào)節(jié)。乳腺癌患者接受他莫昔芬治療后，高表達 BCAR4 患者的無進展生存期(PFS)和 總生存期(OS)都較低表達的患者短[10]。在他莫昔芬敏感細胞系ZR- 75- 1 中過表達BCAR4 能顯著降低他莫昔芬抑制腫瘤細胞的增殖能力，說明BCAR4 可能與乳腺癌對他莫昔芬耐藥相關(guān)。

新近研究發(fā)現(xiàn)了一個新的lncRNA-GASL1[4]，進一步研究發(fā)現(xiàn)：1) GASL1參與調(diào)控細胞周期，可促進細胞由G1向S期轉(zhuǎn)化；2)運用siRNA干擾人骨肉瘤細胞U2OS中GASL1表達可促進細胞增殖和集落形成；3)運用敲除GASL1的U2OS細胞和野生型U2OS建立異種移植建立的荷瘤小鼠模型，GASL1敲除的U2OS小鼠癌組織生長速率比野生型U2OS更快；4)肝癌患者肝癌組織中GASL1的表達水平與患者的生存周期呈正相關(guān)。上述一系列研究表明，GASL1可能是又一個新的參與癌癥發(fā)生發(fā)展的lncRNA。本研究發(fā)現(xiàn)， GASL1乳腺癌患者癌組織和乳腺癌細胞系中表達減少，提示GASL1可能參與調(diào)節(jié)乳腺癌功能。進一研究發(fā)現(xiàn)，過表達GASL1可抑制MCF- 7的增殖，促進其凋亡；干擾GASL1表達可促進MCF- 7的增殖，抑制其凋亡。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)lncRNA GASL1在乳腺癌組織和乳腺癌細胞中表達降低，通過調(diào)節(jié)乳腺癌細胞增殖和凋亡參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。GASL1可能是防治乳腺癌的新靶點和診斷乳腺癌的新型生物標(biāo)志物。GASL1調(diào)節(jié)乳腺癌細胞增殖和凋亡的具體機制和是否參與乳腺癌耐藥尚不清楚，這將是我們下一步研究的重點。