溫度對豚鼠心肌細胞快激活延遲整流鉀電流的調節

王小艷，吳婷婷，龐斯斯，王 森

(南京醫科大學第一附屬醫院 老年醫學科，江蘇 南京 210029)

快激活延遲整流鉀電流(Ikr)是心肌細胞復極化的主要電流，抑制Ikr可使動作電位時程延長，引起早后除極，致心律失常的發生。編碼人類心肌細胞Ikrα亞單位的基因為hERG(human ether-a-go-go-related gene, 或KCNH2)[1]。該基因突變可導致遺傳性長QT綜合征- 2 LQTS- 2，而許多抗心律失常藥物及非抗心律失常藥物對hERG通道的過度抑制是獲得性長QT綜合征的主要發病機制[2- 3]。將hERG基因轉染至中國倉鼠卵母細胞(CHO)上發現hERG電流及其門控特性受溫度的影響較大[4]。本實驗觀察在不同實驗溫度下心肌細胞Ikr電流的大小以及門控特性，為進一步研究心肌細胞Ikr提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級雄性豚鼠[南京醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SYXK(蘇)2013-0015]，體質量250～350 g。

1.1.2 溶液：含鈣臺式液成分(mmol/L, pH 7.4): NaCl 143、 KCl 5.4、 NaH2PO40.25、HEPES 5.0、 MgCl20.5、CaCl21.8和D-glucose 5.6; 無鈣臺式液為含鈣臺式液中不加CaCl2。電極內液(mmol/L, PH 7.4): KCl 140、 CaCl21、 MgCl22、 HEPES 10、 EGTA 11、 Na2-ATP 5和creatine phosphate(disodium salt) 5; 電極外液(mmol/L,PH 7.4) NaCl 140、 KCl 3.5、 CaCl21.5、 MgSO41.4、 HEPES 10, 另外加入10 μmol/L nifedipine阻斷L型鈣電流以及10 μmol/L chromanol 293B阻斷慢激活延遲整流鉀電流。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠心室肌細胞分離：采用酶解法制備心室肌單細胞。取豚鼠心臟,置4 ℃臺式液中，心臟稍加修飾后連于Langendorff灌流裝置上，經主動脈逆向灌流，灌流速度為7 mL/min，先以含鈣臺式液灌流2 min，繼以無鈣臺式液灌流5 min，心臟逐漸停止跳動，予含II型膠原酶0.4 mg/mL和牛血清白蛋白1 mg/mL的無鈣臺式液消化10～15 min，剪下左心室置于KB液中，將左心室組織剪成小碎塊，輕輕吹打3～5 min，以200目尼龍網過濾，500 r/min離心后棄上清液，加入新的KB液。室溫保存2 h后選擇邊緣整齊、表面無顆粒、橫紋清晰、無收縮的細胞用于全細胞膜片鉗的記錄。整個灌流過程中持續通氧，灌流液溫度保持在37 ℃左右。

1.2.2 離子通道電流的記錄：應用全細胞膜片鉗記錄快激活延遲整流鉀電流。膜片鉗放大器(HEKA，EPC9,Germany)同計算機連接。刺激信號及電壓輸入信號的采集均由軟件(Pulse, Pulse-Fit V8.53)控制。膜片鉗參數為：鉗制電壓-40 mv，預刺激從-40 mv至+40 mv，脈寬200 ms，刺激從相應電壓降至-40 mv，脈寬600 ms，記錄外向尾電流。

2 結果

2.1 快激活延遲整流鉀電流(Ikr)記錄及驗證:常溫下記錄到的Ikr尾電流，Ikr特異性阻斷劑多非利特dofetilide(1 μmol/L)可完全阻斷該電流，證明該部分電流即為純的Ikr尾電流(圖1)。

2.2 溫度對Ikr尾電流的影響:Ikr尾電流對溫度極為敏感，在溫度為22 ℃～37 ℃，Ikr尾電流隨著溫度的升高(22 ℃, 27 ℃, 32 ℃, 37 ℃)而增大(圖2A)。當預刺激電壓為+40 mV時，Ikr電流密度由22 ℃時的(0.27±0.15)pA/pC增加到37 ℃時的(0.62±0.15)pA/pC(P<0.01)(圖2B)。半數最大激活電壓(V0.5)從22 ℃時的(-3.59±4.20)mV變為37 ℃時的(-4.45±3.53)mV(圖2C)，slope factor(k)從17.38±3.98變為10.19±3.15(P<0.01)(圖2D)。

Recording of Ikr tail current in the same cell before(A) and after (B) superfusion with dofetilide at room temperature

A.representative Ikr tail current traces recorded at different temperature； B.the current density induced by depolarizing voltage clamp pulse +40 mV at 22 ℃ and 37 ℃； C.the half-maximal activation voltage(V0.5) of the myocytes measured under 22 ℃ and 37 ℃; D.the slope factor (k) of the myocytes measured under 22 ℃ and 37 ℃； *P<0.01 compared with 22 ℃

3 討論

Ikr鉀通道對于正常心臟的電生理活動是必需的，它介導了動作電位3期的復極化，且它是唯一可在每一次動作電位末尾時調控細胞膜復極的電流，對心率的調節及維持細胞的興奮性起重要作用。目前國內外鮮有關于溫度對Ikr電流的調控的研究，將hERG基因轉染到中國倉鼠卵母細胞上，研究溫度對HERG電流的影響，發現溫度升高后，herg的激活曲線向超極化的方向移動，而失活曲線向去極化的方向移動[4]。然而，雖然轉染細胞在研究通道、分子機制方面有強大的優勢，然而鉀通道還存在調節亞單位(β亞單位)如minK,miRP1、激酶結合蛋白、細胞支架成分以及其他的一些蛋白，這些物質在轉染細胞與心肌細胞中有很大的不同，因此，直接對心肌細胞進行研究快激活延遲整流鉀電流很有必要的。

本實驗發現，Ikr電流受溫度的影響較大，隨著溫度的升高，Ikr電流明顯增加，同時半數最大激活電壓(V0.5)和slope factor(k)均隨溫度升高而更小，電壓激活曲線向更負的方向移動。提示當細胞所處環境的溫度從22 ℃升至37 ℃，細胞內的Ikr離子通道更加易于開放，且開放的數量明顯增加，從而介導Ikr電流明顯增加。因此，一定范圍內的溫度變化可以調節單個心肌細胞表面離子通道的啟閉，影響離子通道的電學特點，介導離子流大小的改變，從而影響整體心肌的電活動和動作電位，甚至整體心臟的電生理特征。

有報道，在記錄離子流時所采用的溫度不盡相同，有在室溫下，也有在生理溫度下進行。本研究提示，在記錄Ikr電流時，實驗環境溫度影響電流強度。深入了解溫度對離子通道的影響及機制，可更深入了解心肌細胞的電學特性。