蛋白質精氨酸甲基化轉移酶5在肝細胞肝癌中的表達及其臨床意義

朱 凱，戰 昊，代 智，周 儉

復旦大學附屬中山醫院肝臟外科，復旦大學肝癌研究所，教育部癌變與侵襲原理重點實驗室，上海 200032

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC, 以下簡稱肝癌)是最常見的惡性腫瘤之一。全世界每年約有60萬人死于肝癌，其侵襲、轉移及復發是患者死亡的主要原因[1-4]。因此，探索肝癌侵襲、轉移及復發的分子機制，尋求有效的預防措施，對改善肝癌患者的預后及延長患者的生存時間具有重要意義。

本課題組的前期研究[5]提示，異黏蛋白(metadherin，MTDH)能通過促進上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)增強肝癌細胞的轉移能力，高MTDH表達是肝癌患者的不良預后因素，且MTDH是較好的獨立預后指標。通過免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)結合質譜發現，MTDH能與蛋白質精氨酸甲基化轉移酶5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)形成蛋白復合體。

PRMT5能將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉移至組蛋白上的精氨酸，從而參與多種細胞活動[6-9]。越來越多的研究[10-13]顯示，PRMT5與多種腫瘤的發生發展關系緊密。本研究進一步探討PRMT5在肝癌組織中的表達及其對患者預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2003年1月至2004年3月在復旦大學附屬中山醫院肝臟外科就診的323例接受腫瘤切除手術的肝癌患者的腫瘤及正常肝臟組織的組織芯片。患者術前均無遠處轉移，肝功能分級均為Child-Pugh A級，其中278例(86.1%)感染了乙肝病毒(表1)。323例患者術后中位隨訪時間為66(2.3～74.0)個月。

1.2 免疫組化染色 腫瘤及正常肝臟組織切片經脫蠟、水化、封閉、浸洗等處理后，加入一抗孵育過夜，加入二抗和DAB顯色液，蘇木精復染，梯度乙醇脫水后封片，拍照觀察。

MTDH抗體(ab45338)由Abcam公司提供。結果判定[14]：染色強度以中位光密度(median integrated optical density, mIOD)為分界點分為高表達組和低表達組： 高表達組IOD>mIOD，低表達組IOD≤mIOD。

PRMT5抗體(#2252)由CST公司提供。對組織中核內和核外的染色強度分別評分[15]：采用SPSS軟件計算出IOD的四分位值，將其染色強度由低到高分為-、+、、，并計算各種染色強度所占比例；核內或核外表達評分由“強度×比例”計算得來。如果核內表達評分較高，則判定為核內表達占優勢；反之亦然。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0進行統計學分析。MTDH和PRMT5表達情況與其他臨床病理特征之間關系采用Pearson卡方檢驗；采用Kaplan-Meier法分析患者的生存情況，并對其進行log-rank檢驗。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 PRMT5表達與肝癌患者臨床病理指標及MTDH表達之間的關系 PRMT5高表達者占53.3% (172/323)。Pearson卡方檢驗(表1)提示：PRMT5過表達與年齡、性別、肝硬化、甲胎蛋白(AFP)、腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期及MTDH表達相關(P<0.05)。

表1 肝癌組織PRMT5表達與患者臨床病理指標的相關性 n

續表1 n

PRMT5在細胞核內外均有分布，其中PRMT5核內表達占優勢者(PRMT5核內組)為36.8% (119/323)。卡方檢驗(表1)提示：PRMT5核表達模式與年齡、AFP水平、微血管侵犯、腫瘤分化程度及MTDH表達密切相關(P<0.05)。

免疫組化染色(圖1)顯示：PRMT5在細胞內分布與MTDH存在對應關系。在正常肝臟組織中，MTDH及PRMT5表達均較低；在肝癌組織中，MTDH及PRMT5表達均升高，且有向核外分布的趨勢。

2.2 PRMT5表達對患者預后的評估價值

2.2.1 PRMT5表達量及分布對預后的影響 結果(圖2A～2D)表明：PRMT5高表達組和PRMT5低表達組患者術后1、3、5年總生存率(84.3%vs87.5%，58.6%vs66.2%, 49.9%vs53.6%)及復發率(25.2%vs25.3%, 49.6%vs50.8%, 59.3%vs58.6%)差異均無統計學意義。PRMT5核內組患者術后3、5年總生存率(70.2%vs58.6%, 61.3%vs46.4%)明顯高于PRMT5核外組，復發率則明顯低于PRMT5核外組(23.3%vs27.4%, 43.3%vs54.2%, 50.5%vs64.6%)，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.2.2 MTDH表達量聯合PRMT5分布對預后的影響 結果(圖2E～2H)表明：MTDH高表達PRMT5核外組患者術后1、3、5年總生存率明顯低于MTDH低表達PRMT5核內組(74.0%vs93.7%，39.0%vs80.5%，29.4%vs71.9%)，復發率則明顯高于MTDH低表達PRMT5核內組(43.3%vs13.0%，67.3%vs36.1%，77.2%vs42.9%)，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖1 HCC及癌旁組織MTDH、PRMT5蛋白的表達

A：在正常肝臟組織中，MTDH與PRMT5表達均較低；B：肝癌標本1，MTDH表達量中等、PRMT5表達量高，PRMT5主要分布于細胞核；C：肝癌標本2，MTDH、PRMT5表達量高，PRMT5主要分布于核外.Original magnification: ×40(原圖)，×200(放大)

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析PRMT5和(或)MTDH表達對肝癌預后的預測價值

PRMT5表達對患者的總生存率(A)及復發率(B)無顯著影響；PRMT5核內表達占優勢的患者總生存率(C)更高，復發率(D)更低；MTDH表達升高的患者總生存率(E)更低，復發率(F)更高；MTDH高表達PRMT5核外組患者生存率明顯低于MTDH低表達PRMT5核內組(G)，復發率明顯高于MTDH低表達PRMT5核內組(H)

2.3 患者預后的影響因素分析 單因素和多因素分析結果(表2、表3)表明：PRMT5分布(P<0.05)與MTDH表達(P<0.01)是影響肝癌患者術后生存率與復發的獨立預測因素，且兩者聯合應用的預測價值更大(P<0.001)。

表2 患者術后總生存期和疾病復發的單因素回歸分析

表3 患者術后總生存期和疾病復發的多因素回歸分析(Cox模型)

*將單因素分析中有統計學意義的因素納入多因素分析

3 討 論

PRMT5對細胞功能具有重要的調節作用，其在多種惡性腫瘤中異常表達[7-9]。Powers等[7]發現，乳腺癌組織中PRMT5高表達提示預后不良。Chen等[16]證明，PRMT5通過TGFβ-PRMT5-MEP50通路調節乳腺癌和肺癌細胞的EMT。近期研究[9, 17]顯示，PRMT5在白血病及淋巴瘤中發揮重要作用。

本研究中，53.3%患者的肝癌組織表達PRMT5高于對應的正常肝臟組織，但表達高、低組患者預后差異無統計學意義；PRMT5表達核內組患者生存率與復發率高于PRMT5表達核外組(P<0.05)。本研究中，MTDH表達低，PRMT5主要分布于細胞核；隨著MTDH表達升高，PRMT5表達明顯升高，且有向核外分布的趨勢；MTDH表達和PRMT5分布均是肝癌的獨立預后因素，且兩者聯合應用的的預測價值更高(P<0.001)。

PRMT的主要功能為通過甲基化組蛋白H3、H4的精氨酸，改變染色體結構，參與基因轉錄、DNA修復和RNA合成等[9, 18-19]。其在惡性腫瘤中發揮作用的機制還未完全清楚。近期有研究[20]顯示，PRMT5能與Ajuba以及Snail形成蛋白復合體，從而抑制EMT關鍵分子E-cadherin的表達。本課題組前期研究[21]也提示，MTDH高表達能促進β-catenin由胞質向胞核內轉移。PRMT5可能通過上述機制促進肝癌細胞EMT，進而在MTDH介導的肝癌EMT中發揮作用。后續研究中我們將進一步探討MTDH、PRMT5與E-cadherin以及β-catenin之間的關系。

綜上所述，本研究顯示PRMT5在肝癌細胞中的分布與肝癌的侵襲和預后密切相關，PRMT5在肝癌細胞中的分布和(或)MTDH表達水平可作為肝癌預后的潛在預測指標。