肺腺癌組織精氨酸酶-2的表達及臨床意義

肖 鋒，徐光寰，顧春燕，邵建國，陳麗燕，孫 艷，肖靜文

1.南通大學附屬南通第三醫院病理科，南通 226006 2.海軍軍醫大學附屬長海醫院普通外科，上海 200433 3.南通大學附屬南通第三醫院消化內科，南通 226006

目前，肺癌是全世界所有癌癥相關死亡的主要原因之一。非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)是最常見的肺癌類型，其根據組織起源主要包括腺癌和鱗狀細胞癌。近年來，肺腺癌發病率明顯升高；盡管肺腺癌的治療取得了長足的進步，但由于其生物學特性復雜、復發轉移率高，手術切除后肺腺癌患者的長期生存率仍然較低。因此，更深入地研究與肺腺癌發生和發展相關的因子及分子機制對于肺腺癌的早期診斷、復發和轉移的監測，以及療效和預后的判斷具有重要意義。

精氨酸酶-2(arginase-2, Arg-2)是生物體新陳代謝過程中重要的催化酶，主要催化L-精氨酸水解成尿素和L-鳥氨酸。Arg-2在人類多種惡性腫瘤中異常表達。本課題組前期研究顯示[1-2]，肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)組織中Arg-2異常表達，并且與HCC組織學分級、細胞增殖和凋亡等相關。本研究擬進一步探討Arg-2在肺腺癌中的表達情況及臨床病理學意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南通大學附屬南通第三醫院2011年12月至2017年10月收集的病例資料完整的肺浸潤性腺癌手術切除標本(包括癌及其癌旁組織)108例。浸潤性肺腺癌的診斷參考國際肺癌研究協會/美國胸科學會/歐洲呼吸學會國際肺腺癌多學科分類分型診斷標準[3]。組織學分級標準：(1)高分化，以貼壁結構為主；(2)中分化，包括乳頭狀、腺泡結構為主和浸潤性黏液腺癌；(3)低分化，以實體和微乳頭狀結構為主[4]。所有病例均經過2位中級以上職稱的病理醫師復習診斷，并接受6個月～6年生存隨訪。另外，收集7例新鮮的肺腺癌組織標本和1例正常肺組織標本，正常肺組織為肺大皰手術切取的周圍肺組織；-80℃保存。本研究通過南通市第三人民醫院倫理委員會審核批準。

1.2 RT-PCR實驗 參照TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取新鮮組織中總RNA，紫外分光光度計測定D260及D280值，計算RNA總含量。反轉錄反應根據反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)使用說明進行，將所合成的cDNA保存于-20℃以備用。Arg-2上游引物：5′-AAG CTG GCT TGA TGA AAA GGC-3′，下游引物：5′-GCG TGG ATT CAC TAT CAG GTT GT-3′，產物長度為119 bp；內參GAPDH上游引物：5′-CCA TTT GCA GTG GCA AAG-3′，下游引物：5′-CAC CCC ATT TGA TGT TAG TG-3′，產物長度為202 bp。PCR反應體系總體積為20 μL，反應條件：94℃ 5 min；94℃ 45 s、58℃ 45 s、72℃ 45 s，共30個循環；72℃ 8 min。對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，最后用凝膠分析系統對目的條帶進行半定量分析。

1.3 蛋白質印跡實驗 將凍存的新鮮組織標本取出稱取質量，加入蛋白裂解液，冰浴勻漿。待組織完全打碎后，以12 000×g的相對離心力于4℃離心30 min，取上清液測定蛋白含量。對蛋白樣品行SDS-PAGE，電泳結束后進行濕式電轉移。轉移后的PVDF膜于室溫封閉2 h，分別加入兔抗人多克隆Arg-2和小鼠抗人單克隆β-actin一抗(Santa Cruz公司產品)，室溫孵育1 h后，4℃過夜。TBST漂洗后，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔/小鼠二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗。ECL發光，暗室中顯影，定影。

1.4 免疫組織化學實驗及結果判定 采用EnVision二步法進行免疫組織化學檢測，具體步驟參照免疫組織化學試劑盒(上海基因科技有限公司)說明書進行。手術標本離體30 min內行固定、常規組織學脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋處理，4 μm厚切片。實驗設陽性和陰性對照。檸檬酸鹽高壓抗原修復后，加入一抗4℃孵育過夜，然后加入二抗室溫孵育2 h，DAB顯色。由2位中級以上病理醫師采用雙盲法評定染色結果。每張切片在400倍放大光學顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數1 000個癌細胞，計算染色細胞陽性率。采用半定量積分法對癌細胞染色強度和染色細胞陽性率進行評分。染色強度分為4個等級：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，無著色為0分。染色細胞陽性率分為5個等級：81%～100%為4分，51%～80%為3分，11%～50%為2分，1%～10%為1分，無染色細胞為0分。將2組評分相乘所得值，分為2個等級：0～4分為低表達，5～12分為高表達。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件分析處理數據。對免疫組織化學檢測結果行χ2檢驗，組間比較采用Spearman秩相關分析。對隨訪結果行單因素分析，總生存率分析用log-rank檢驗，并繪制Kaplan-Meier生存曲線。應用多因素Cox比例風險模型評估對生存有明顯影響的獨立因素。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 Arg-2在新鮮肺腺癌組織中高水平表達 RT-PCR檢測1例正常肺組織和7例肺腺癌組織中的表達，結果(圖1A)顯示：在正常肺組織中，Arg-2 mRNA無表達；而在7例新鮮肺腺癌組織中，有6例(case1、2、3、5、6、7)Arg-2 mRNA表達水平明顯升高，對應的癌旁肺組織中Arg-2 mRNA不表達或低表達，另外1例患者(case 4)的癌組織和癌旁組織中均不表達Arg-2 mRNA。蛋白質印跡法檢測結果(圖1B)顯示：Arg-2在蛋白水平的表達情況與mRNA水平基本一致。以上結果說明，Arg-2在癌旁肺組織中不表達或低表達，而在肺腺癌組織中表達水平明顯升高。

2.2 Arg-2在肺腺癌組織中表達率升高 應用免疫組織化學法進一步檢測Arg-2在108例肺腺癌及其對應癌旁肺組織中的表達情況，結果顯示：Arg-2陽性信號定位于細胞質(圖2)；在108例肺腺癌組織中，Arg-2蛋白低表達者74例，高表達者34例；而對應的108例癌旁組織中Arg-2蛋白均低表達。因此，Arg-2在肺腺癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織(P<0.000 1)。

圖1 RT-PCR(A)和蛋白質印跡法(B)分別檢測1例正常肺組織、7例肺腺癌及相應癌旁肺組織中Arg-2 mRNA和蛋白的表達

圖2 免疫組織化學法檢測Arg-2在肺腺癌組織中的表達及細胞定位(EnVision二步法)

A：Arg-2在肺腺癌組織中高表達；B,C：圖A的局部放大，B示Arg-2高表達于癌細胞的細胞質，C示癌旁肺組織中不表達Arg-2；D：Arg-2在肺腺癌組織中低表達；E,F：圖D的局部放大，E示Arg-2低表達于癌細胞的細胞質，F示癌旁肺組織不表達Arg-2.Origiral magnification: ×100(A,D), ×400(B,C,E,F)

2.3 Arg-2表達與肺腺癌臨床病理指標的相關性分析 結果(表1)顯示：Arg-2蛋白表達與肺腺癌的分化程度(P=0.000 6)、淋巴結轉移(P=0.002 8)、TNM分期(P=0.021 5)以及Ki-67指數(P<0.000 1)正相關，而與肺腺癌患者的性別、年齡、吸煙狀態及腫瘤大小均無顯著相關。

表1 Arg-2表達與肺腺癌臨床病理特征的相關性 n, N=108

2.4 Arg-2蛋白與肺腺癌患者預后的相關性分析 Kaplan-Meier生存曲線(圖3)顯示：Arg-2低表達組肺腺癌患者的中位生存時間為42個月，Arg-2高表達組肺腺癌患者的中位生存時間為17個月；log-rank檢驗結果顯示，Arg-2高表達組的總生存率明顯低于Arg-2低表達組，兩組間差異有統計學意義(χ2=6.762,P=0.009)。進一步應用Cox比例風險模型分析Arg-2高表達對肺腺癌患者生存的影響，結果(表2)顯示：Arg-2高表達組與低表達組的危害比(hazard ratio, HR)為0.492，95%可信區間(confidence interval，CI)為0.241～1.004(P=0.051)，提示Arg-2高表達不是肺腺癌的獨立預后因素。

圖3 Arg-2低表達與高表達組肺腺癌患者的生存曲線

表2 多因素Cox比例風險模型分析肺腺癌的獨立預后因素

SE：標準誤差；DF：自由度；HR：危害比；CI：可信區間；Lower：下限；Upper：上限.*顯著相關

3 討 論

Arg-2是一種線粒體酶，基因定位于染色體14q24.1-24.3，廣泛分布于腦、乳腺、前列腺和腎臟等臟器[5-6]，其主要功能是促進人體新陳代謝，并調節免疫功能等。有研究表明，Arg-2的異常表達與癌癥有著密切的關聯。Arg-2在前列腺癌和乳腺癌等腫瘤組織中高水平表達[7-8]。本研究組之前的研究發現，Arg-2在HCC組織中也存在異常表達，表達強度與HCC的組織學分級正相關，提示Arg-2可能與HCC的生物學行為相關[1]。最近本研究組進一步研究顯示，HCC組織中Arg-2表達與細胞增殖標志物Ki-67和細胞周期調控蛋白cyclin D1表達正相關，提示Arg-2異常表達可能參與調節HCC細胞的增殖過程[2]。

本研究結果顯示Arg-2 mRNA和蛋白表達水平在肺腺癌組織中明顯升高，而且Arg-2蛋白在肺腺癌組織中異常高表達與肺腺癌組織分化差、淋巴結轉移、TNM分期及增殖指數高正相關。因此，Arg-2高表達可能提示肺腺癌患者預后差。Costa等[9]研究也顯示，過表達Arg-2能夠促進成膠質細胞瘤中基質金屬蛋白酶2/9表達，進而促進腫瘤細胞增殖、遷移和血管生成。以上2項研究結果均表明，Arg-2與腫瘤的惡性生物學行為密切相關，Arg-2可能在其中發揮重要作用。由于納入本研究的少部分病例的隨訪時間較短，故本研究進一步行多因素Cox比例風險模型分析，結果顯示Arg-2高表達不是獨立的危險因素。本研究結果表明，Arg-2可能在肺腺癌的侵襲和轉移中起著重要的作用，Arg-2高表達提示預后差，但不是獨立的預后因素。

分析Arg-2發揮生物學功能的作用機制，可能包括以下途徑：Arg-2通過催化精氨酸，合成精胺和亞精胺等，在促進細胞增殖和分化過程中發揮非常重要的功能[10-11]。Arg-2與誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)均以精氨酸作為催化底物，Arg-2通過競爭性催化精氨酸，調節iNOS催化合成NO的量，從而影響NO發揮調節腫瘤血管生成[12]、細胞毒性反應及腫瘤免疫等生物學功能，最終調控腫瘤的增殖和凋亡等生物學進程。本研究組近期也報道，Arg-2與iNOS在HCC組織中的表達正相關，且與HCC微血管密度相關，提示Arg-2與iNOS可能參與調節HCC微血管的形成[13]。另外，Arg-2與淋巴細胞介導的腫瘤免疫有關。Arg-2通過水解精氨酸，抑制T細胞增殖，最終影響機體對腫瘤細胞的免疫抑制功能[14-15]。McGovern等[16]的研究結果表明，在人胚胎發育過程中，Arg-2的活化能促進調節性T淋巴細胞產生，從而發揮重要的免疫調節作用；Arg-2還能夠激活骨髓源性抑制細胞，這種細胞由腫瘤誘導所產生，主要發揮免疫抑制作用，介導癌癥患者的系統性免疫功能障礙和局部的腫瘤免疫逃避[17]。總之，Arg-2可通過多種途徑影響腫瘤細胞的生物學行為。

綜上所述，本研究明確了浸潤性肺腺癌組織中Arg-2的異常表達與組織分化差、淋巴結轉移、TNM分期及增殖指數高正相關，提示Arg-2可能參與調控肺腺癌的惡性生物學行為；同時Arg-2高表達提示患者預后差，但不是獨立的預后因素。進一步探索Arg-2在肺腺癌組織中的作用機制將拓寬和深化人們對Arg-2功能的更全面的認識，并對闡明肺腺癌的發病機制可能提供新的思路。